Name: in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina
Uploaded: 2011-12-27T12:00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Freimann Life Science Center og Center for sebrafisk forskning personalet for deres stell og vedlikehold av sebrafisk.

1. Morpholino forberedelse: <ol><li> Alle morpholino oligos bør være spesialdesignet og bestilles gjennom GeneTools (Philomath, OR). Vi bruker den positivt ladde lissamine-merket morpholinos å drive electroporated morpholinos mot den negative elektroden. Vi prøvde, uten hell, å målrette negativt ladede fluorescein-merket morpholinos til den positive elektroden ved hjelp av denne teknikken. Fortynn 300 nmol av morpholino inn i 100 mL av nukleasefritt vann for å gi en 3 mM løsning. Delmengde av morpholino i flere parafin-forseglet Mikrosentrifugerør. Lagres adskilt fra lys ved romtemperatur. </li><li> Bestem morpholino konsentrasjonen ved å fortynne 5 mL av morpholino (eller vann som brukes til å fortynne morpholino som en blank) i 95 mL på 0,1 N HCl. Still spektrofotometeret bølgelengde (λ) til 265 nm. Beregn konstant for morpholino ved hjelp av følgende ligning: Konstant = molekylvekt særlig morpholin dino X 1000/molar absorbans. </li><li> Du finner molekylvekt og molar absorbansen data på &quot;Oligo Properties&quot; ark følger med hver morpholino. Analyser blank å verifisere baseline målinger og ta målinger av hver fortynnet morpholino. Multipliser absorbans ved 265 nm av hvert morpholino ved sin klare konstant og med fortynningsfaktoren for å få konsentrasjonen i ng / mL. Dele dette tallet med molekylvekten for å bestemme konsentrasjonen i mM. Fortynn morpholino, om nødvendig, til en fungerende konsentrasjon. </li></ol> 2. Fjern ytre hornhinnen lag: <ol><li> Anesthetize 6-12 mnd gammel voksen sebrafisk i Tricaine eller 2-Phenoxyethanol på 1,0 mg / ml i sebrafisk tank vann. </li><li> Pakk sebrafisk i en fuktet papir håndkle, dekker gjellene, men forlater øyet utsettes. Den innpakket fisk er plassert under en stereoscope og forstørrelse er økt til diameteren på øyet fyller omtrent en tredjedel avdet visuelle feltet (figur 1). </li><li> Bruk Dumont # 5 pinsett, ta tak i ytre hornhinnen nær den optiske sprekken. Dette vevet er farget i rødt og er merket &quot;OC&quot; i figur 1. Det er en liten utvekst eller leppe angitt med pil merket &quot;CL&quot;. Dra til en lav vinkel (dvs. 10 grader) over øyet for å fjerne den ytre hornhinnen. Med praksis kan dette være ferdig i én bevegelse. Hvis pinsett slip, re-tak i vev og igjen dra til en lav vinkel inntil fjernet. En godt festet hornhinnen kan føre øyet å bli løsner fra kontakten når trukket. Du kan holde øyet blir forskyves ved stabiliserende med et annet sett med pinsett. </li></ol> 3. Hornhinnen snitt og morpholino injeksjon: <ol><li> Umiddelbart etter fjerning av ytre hornhinnen, lage et lite snitt i hornhinnen der eleven møter iris (Figur 2). Dette gjøres ved hjelp av en safir blad skalpell (Se Materials). </li><li> Load 0,5 mL av 3,0 mm morpholino løsning til en Hamiltpå sprøyte utstyrt med en 33 gauge flyttbar, butt-end nål (Se Materials). Pipetter opp og ned for å fjerne luftbobler i linjen. Forsiktig inn nålen inn i glasslegemet gjennom snittet (Figur 2). Ikke sett inn nålen for langt, eller du vil punktere netthinnen eller fortrenge linsen. </li><li> Sakte injisere morpholino løsningen inn i glasslegemet plass. Avhengig av alderen på fisken, vil glasslegemet plassen holde ~ 0,5 mL. Du bør visualisere ufargede glasslegemet lekker ut av innsnitt som det er fortrengt av morpholino løsningen. Injisere inntil en liten mengde morpholino løsning lekker ut av snittet. Du bør tydelig visualisere lissamine-merkede morpholino inne i øyet. </li><li> Etter injeksjonen, returnere fisken til tanken å komme seg. Vi vanligvis bare injisere det venstre øyet, ved hjelp av høyre øye som en uninjected kontroll, men electroporation av begge øyne er mulig. </li></ol> Fire. Electroporation: <ol><li> Etterinjeksjon av ca 10 fisk, re-anesthetize en injisert fisk og pakk den i en fuktet papir håndkle, bare dekker gjellene, men forlater øyet utsettes. Overfør fisken til en petriskål. Sett på latex eller lignende hansker for å unngå eksponering for anestesi. Mens forsiktig holder fisken til bunnen av fatet, fyll fatet med anestesi (figur 3, venstre panel). </li><li> En 3-mm-diameter platinum plate elektrode (Se Materials) lokaliserer den electroporation pulsene til omtrent halvparten av netthinnen. Vi vanligvis målrette dorsal netthinnen. Trykk forsiktig positive elektroden nedover på baksiden halvdelen av øyet. Med ytre hornhinnen fjernet, er øyet lett roteres, utsette dorsal del av øyeeplet. </li><li> Mens han fortsatt trykke ned på den ventrale siden av øyet, plasser den negative elektroden nær (~ 1 - 2 mm) den eksponerte dorsal halvdelen av øyet. Vær forsiktig så du ikke berører den negative elektroden direkte til øyet, noe som vil resultere i skadedorsal netthinnen. Når du bestemme passende avstand mellom elektrodene, bruker justeringsskruen på håndtaket av elektrodene å opprettholde det spres når electroporating. Dette holder negative elektroden en optimal avstand fra øyeeplet da den positive elektroden er presset ned i stilling. </li><li> Electroporate øyet med en CUY21 Square Wave Electroporator (Se Materials). Den electroporation parametrene bør settes til to etterfølgende 50-msek pulser, på 75 V med en 1-sec pause mellom pulser. </li><li> Tilbake fisk til tanken. Vi vanligvis starter vår protokoll for konstant lys-indusert retinal degenerasjon umiddelbart etter electroporation. </li></ol> 5. Representative resultater: <ol><li> For 3-5 dager etter electroporation (avhengig av stabilitet morpholino), kan lissamine etiketten skal visualiseres i alle netthinnens lag i en seksjonert netthinnen (figur 4). Dette fungerer som en bekreftelse for tilstedeværelsen avden merkede morpholino. </li><li> Vi kan oppnå full protein knockdown opptil 3-5 dager etter electroporation, avhengig av effekten av morpholino (figur 5). Vanligvis, under lysbehandling studiene, høster vi øynene på 3 eller 4 dager etter morpholino electroporation. Dette gjøres ved å fjerne hele øyet med Dumont # 5B tang med buet ender (figur 6; Materials) og behandle vev for immunhistokjemi 15. Som med alle knockdown teknikk, må en demonstrasjon av effektive knockdown bli vist for å validere fenotype. Derfor foreslår vi å skaffe antisera for dine protein av interesse. Alternativt, hvis og antistoff ikke er tilgjengelig, og morpholino er rettet mot enten spleise akseptor og donor område i pre-mRNA, vil den blokkere effektiv skjøting av mRNA. I dette tilfellet er det mulig å benytte revers transkriptase-PCR for å forsterke flankerer sekvenser i morphant RNA og bestemme effektiviteten blokkerer normal splicing mønster. </li><li> Når netthinne er seksjonert fra nese til timelige på dorsal ventral aksen, de skyggelagte blå boksene (figur 6) representerer områder av netthinnen som oftest skadet fra electroporation arrangementet selv. Det skraverte rosa boksen representerer det området som er målrettet for morpholino innføring i netthinnens celler av electroporation. </li></ol><img alt="Figur 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> Figur 1. Skjematisk som viser fjerning av epitel lag av hornhinnen. Det venstre panelet viser store strukturelle trekk i øyet, inkludert linse (L), glasslegemet (VIT), netthinnen (R), den ytre hornhinnen (OC), den indre hornhinnen (IC), og hornhinnen protrusion ( CL). Orienteringen av øyet vises i nedre høyre i første panelet og er merket anterior (A), posterior (P), dorsal (D), og ventral (V). Den røde fargen angir den ytre hornhinnen som er fjernet. Den andre pan<html> el viser hvordan pinsett brukes til å gripe hornhinnen protrusion og å trekke den ytre hornhinnen over øyet til en lav vinkel (tredje panel). Den høyre panel viser hvordan et sekund pinsett kan brukes til å stødig øyet mens du trekker hornhinnen. <img alt="Figur 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> Figur 2. Skjematisk av trinnene involvert i intravitreal injeksjon av morpholino. Et lite snitt er gjort i øyet der eleven møter iris (venstre panel). Den resulterende gapet skal være akkurat stor nok for en 33 gauge nål, som er fylt med morpholino løsningen, som skal settes inn (midterste panel). Sakte injisere 0,5 mL av løsningen inn i glasslegemet (høyre panel). Du bør visualisere en liten mengde av glasslegemet løsning kommer ut av innsnitt som glasslegemet er delvis erstattet av med lissamine-merket morpholino (høyre panel). ig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3. Skjematisk av den generelle electroporation prosedyren. Den bedøvet fisk, som var intravitreally injisert med morpholino, er forsiktig pakket inn i fuktig papir håndkle (venstre panel). Den papirhåndkle skal dekke gjellene, men ikke hindre øyet (i midten panel). Trykk forsiktig positive elektroden ned på den ventrale delen av øyet, slik at dorsal halvdelen av øyet å rotere ut av stikkontakten. Plasser den negative elektroden ca 1 mm fra dorsal halvdelen av øyet og starte electroporation (høyre panel). <img alt="Figur 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> Figur 4. Confocal image sammenligne en netthinnen electroporated uten intravitreally injisere en lissamine-tagget morpholino (A), og en netthinnen intravitreally injisert og electroporated med lissamine-merkede morpholino (B). Den lissamine label er funnet i alle netthinnens lag og celletyper. ROS, rod ytresegmenter; onl, ytre kjernefysisk lag, INL, indre kjernefysisk lag; GCL, ganglion celle lag. <img alt="Figur 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> Figur 5. Confocal bilder sammenligne PCNA immunolocalization i netthinne electroporated med en kontroll morpholino (venstre panel) og netthinne electroporated med en anti-PCNA morpholino (høyre panel) før lysindusert fotoreseptor celledød. Dark-tilpasset voksen albino sebrafisk ble plassert i konstant intense lys for 1, 2 eller 3 dager etter electroporation av morpholino. Kontrollen morpholino mislyktes i å undertrykke økende PCNA uttrykk i lys-skadet netthinner. Den anti-PCNA morpholino effektivt slått ned PCNA protein uttrykk gjennom tre dager med konstant intens lys skade. <img alt="Figur 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> Figur 6. Skjematisk (venstre panel) viser enucleation av øyet for pBearbeiding og cryosectioning, som er gjort langs dorsal ventral aksen. Den rosa skyggelagte boksen (høyre panel) viser retinal regionen med størst mengde protein knockdown å bruke denne teknikken. Den blå skyggelagte bokser representerer områder som oftest ødelagt av electroporation hendelsen. Orienteringen av øyet er merket anterior (A), posterior (P), dorsal (D), og ventral (V).

<ol>
	<li>Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proneural+basic+helix-loop-helix+gene+ascl1a+is+required+for+retina+regeneration.">The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).</li><li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+inner+retinal+neurons+after+intravitreal+injection+of+ouabain+in+zebrafish.">Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li><li>Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+injury-induced+neurogenesis+in+the+vertebrate+retina.">Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-+and+dose-dependent+influence+of+ouabain+on+the+ultrastructure+of+optic+neurones.">Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones.</a> Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).</li><li>Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cones+regenerate+from+retinal+stem+cells+sequestered+in+the+inner+nuclear+layer+of+adult+goldfish+retina.">Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).</li><li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Muller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish.">Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li><li>Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regional+differences+in+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+light-lesioned+albino+zebrafish.">Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish.</a> Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).</li><li>Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish.">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antisense+inhibitor+of+MMP-9+attenuates+angiogenesis,+human+prostate+cancer+cell+invasion+and+tumorigenicity.">A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity.</a> Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Muller+glia+and+neuronal+progenitors+during+adult+zebrafish+retinal+regeneration.">Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration.</a> Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).</li><li>Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+intact+and+regenerating+zebrafish+retina.">Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina.</a> Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).</li><li>Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+galectin+Drgal1-l2+is+expressed+by+proliferating+Muller+glia+and+photoreceptor+progenitors+and+regulates+the+regeneration+of+rod+photoreceptors.">The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).</li><li>Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6a+and+Pax6b+are+required+at+different+points+in+neuronal+progenitor+cell+proliferation+during+zebrafish+photoreceptor+regeneration.">Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration.</a> Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+glial+cell+division+blocks+regeneration+of+the+light-damaged+zebrafish+retina.">Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina.</a> Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre

Nylig undersøkte to microarray analyser av genuttrykk endringene som oppstod under regenerering av enten lys-skadet netthinnen eller en kirurgisk-excised retinal patch 10, 16. Begge studiene viste en rekke gener som viste signifikante endringer i uttrykk, enten øker eller reduserer, som sannsynligvis er nødvendig for forskjellige hendelser som skjer under retinal regenerasjon, som re-entry av Müller gliaceller inn i cellen syklus, fortsatte spredning og migrasjon av neuronal stamfedre til den skadede retinal laget, og differensiering av nevrale stamceller i riktig nevronale celletype. Mens en direkte sammenligning av disse to microarray datasettene avslører kandidat gener som kan være involvert i disse cellulære begivenhetene, til slutt disse genene og deres kodet proteiner må testes for å avgjøre om de er nødvendige for neuronal regenerasjon. Her beskriver vi et kraftig tap-av-funksjon tilnærming til conditionalt knockdown proteiner av interesse i den voksne sebrafisk netthinnen. Denne teknikken har blitt brukt til å studere både ekstracellulære og intracellulære proteiner, samt signalmolekyler, transkripsjonsfaktorer og proteiner som kreves for DNA replikasjon 17-19. Dermed har denne metoden i stor grad hjulpet vår forståelse av den molekylære mekanismen underliggende voksen retinal regenerering i sebrafisk. Vi testet flere electroporation parametre (spenning, antall pulser, tid mellom pulser) før en vellykket protokoll ble oppnådd. En tidligere rapport om electroporating morpholinos i regenererende sebrafisk caudal fin brukt 10 pulser ved lav spenning (15 V) 20. Fordi voksen sebrafisk netthinnen er omgitt av flere cellelag og er ikke lett tilgjengelig for Pinsett elektroder, ble parametrene brukt i fin mislykkede ved effektivt electroporating morpholinos inn i voksen netthinnen. Motsatt vil en høy spenning (100 V) ofte resulted i døden for fisken. Nylig, 5 pulser av 80 V ble beskrevet å electroporate plasmid DNA inn i nyfødte mus valp netthinnen 21. Vi fant at en litt mindre intens 2 pulser av 75 V resulterte i vellykket electroporation av morpholinos inn i den voksne sebrafisk netthinnen med overlevelse på 100% av de behandlede fisken. I tillegg oppdaget vi at fjerningen av den ytterste (eller ekstern-mest) komponent av hornhinnen betydelig økt electroporation effektivitet. Øke antall pulser kan eliminere behovet for fjerning av dette vevet, men kan også føre til større vevsskade. Omfattende kontroll studier vist at disse parametrene ikke medføre noen vesentlig retinal celledød eller endre spesifikke cellulære responser observert under fotoreseptor regenerering 19. Gain-of-funksjon studier er for øyeblikket ikke mulig å bruke denne teknikken in vivo, på grunn av manglende evne våre å konsekvent electroporate store ribonucleic syrer i alle retinal celler. Imidlertid antyder suksess electroporating plasmider inn musen netthinnen in vivo og sebrafisk netthinnen i explants det er fortsatt en mulighet i 21 sebrafisk, 22. En av styrkene til denne teknikken er electroporation ser ut til å effektivt introdusere morpholino inn alle de forskjellige retinal celletyper. Imidlertid var en potensiell svakhet at electroporation effektivt leverte morpholino inn bare de dorsale og sentrale retinal regioner. En annen electroporation event mot ventrale halvdelen av netthinnen resulterer i god rettet til alle lag, men ofte resulterer i skade. Denne romlige restriksjonen sannsynlig skyldtes form og plassering av elektrodene. Bruken av spesialdesignede kopp formet elektroder som kan plasseres rundt øyet kan forbedre denne svakheten. Denne romlig begrensning av morpholino levering begrenser bruken av denne teknikken, og utelukker bruk av en analyse lykkesh som ERG analyse som ville kreve en global vurdering av netthinnen. Det bør bemerkes at som med alle morpholino eksperiment, er det tilrådelig å bekrefte resultater ved hjelp av en annen, ikke-overlappende morpholino til målet mRNA. I noen tilfeller er det mulig å også electroporate to forskjellige morpholinos samtidig for å knockdown uttrykk for to forskjellige proteiner. Vi viste dette ved å slå ned uttrykket av både Pax6a og Pax6b proteiner, enkeltvis og i kombinasjon 18 år. Selv om vi demonstrerte bruken av denne teknikken med våre lys skademodell, kan det trolig bli brukt til å studere regenerering i annen skade modeller 2-8 eller brukt til å undersøke funksjonen av proteiner i uskadet netthinnen. For eksempel kan electroporation av morpholinos brukes til knockdown uttrykket av bestemte kanaler eller signal transduksjon molekyler i ganglion eller amacrine celler og deretter studere funksjonen til disse signaleringstier i visuell prosessering. Men som morpholinos bare påvirker oversettelsen av nye protein, ville man vente til endogent protein omsetningen skjer før en analyse kunne utføres. Avhengig av stabiliteten av proteinet, kan den variere fra timer til dager 18 år.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT eller CUY21-SC Square wave electroporator </td><td> Protech International </td><td> CUY21EDIT eller CUY21SC </td><td> Begge enhetene fungerer for denne protokollen </td></tr><tr><td> 3 mm diameter padle elektroder </td><td> Protech International </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino bør være spesialdesignet til din protein av interesse </td></tr><tr><td> 2-Phenoxyethanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anestesi; fortynne 1:1000 i fisk system vann for prosedyren, 1:500 for aktiv dødshjelp </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinsett </td><td> Verden presisjonsinstrumenter </td><td>14095 </td><td> Eventuelle # 5 pinsett med arbeid </td></tr><tr><td> Dumont # 5B pinsetten med vinklet tips </td><td> Verden presisjonsinstrumenter </td><td> 500234 </td><td> Brukes til å enucleate øye følgende dødshjelp </td></tr><tr><td> Sapphire blad, dobbelt kanten lanse, 1 mm bred, med Sapphire kniv håndtak </td><td> Verden presisjonsinstrumenter </td><td> Blade: 500314 Handle: 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton sprøyte med avtagbare 33 gauge stump-end nål </td><td> Hamilton selskapet </td><td> Sprøyte: 87930 Needle: 7762-06 </td><td> Fjern nål som kommer med sprøyte og erstatte med 33-gauge stump-end nål </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Mange ødeleggende arvelige øyesykdommer resultere i progressive og irreversible blindhet fordi mennesker ikke kan regenerere døde eller syke retinal nerveceller. I kontrast, besitter den voksne sebrafisk netthinnen den robust evne til spontant regenerere noen neuronal klasse som er tapt i en rekke forskjellige retinal skade modeller, inkludert retinal punktering, kjemiske ablasjon, konsentrert høy temperatur, og intense lysbehandling 1-8. Vår lab utstrakt preget regenerering av fotoreseptorene følgende konstant intens lysbehandling og indre retinal nevroner etter intravitreal ouabain 2 injeksjon, 5, 9. I alle tilfeller, bosatt Müller gliaceller re-gå inn i cellen syklus å produsere nevrale stamceller, som fortsetter å spre seg og migrere til riktig retinal lag, hvor de differensieres til den mangelfulle nerveceller. Vi karakterisert fem forskjellige stadier under regenerering av lys-damaGED netthinnen som ble fremhevet av spesifikke cellulære responser. Vi identifiserte flere differensielt uttrykte gener på hvert stadium av retinal regenerering av mRNA microarray analyser 10. Mange av disse genene er også avgjørende for utvikling av synet. For å teste hvilken rolle hver kandidat gen / protein i løpet av retinal regenerasjon, trengte vi å utvikle en metode for å betinget begrense uttrykket av en kandidat protein bare til tider under regenerering av den voksne netthinnen. Morpholino oligos er mye brukt til å studere tap av funksjon av spesifikke proteiner under utviklingen av sebrafisk, Xenopus, kylling, mus, og svulster i menneskelig xenografts 11-14. Disse modifiserte oligos basepair med komplementære RNA sekvensen enten blokkere spleising eller oversettelse av målet RNA. Morpholinos er stabile i cellen og kan eliminere eller &quot;knockdown&quot; protein uttrykk i tre til fem dager 12. Hervi beskriver en metode for å effektivt knockdown mål protein uttrykk i den voksne sebrafisk netthinnen. Denne metoden benytter lissamine-merkede antisens morpholinos som er injisert i glasslegemet av den voksne sebrafisk øyet. Ved hjelp av elektroder tang, er morpholino da electroporated i alle celletyper i dorsal og sentrale netthinnen. Lissamine gir ladningen på morpholino for electroporation og kan visualiseres å vurdere tilstedeværelse av morpholino i netthinnens celler. Betinget knockdown i netthinnen kan brukes til å undersøke betydningen av spesifikke proteiner til ulike tider i løpet av regenerering. I tillegg kan denne tilnærmingen brukes til å studere rollen til spesifikke proteiner i uskadet netthinnen, i slike prosesser som visuelle transduksjon og visuell prosessering i andre ordens nevroner.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

En metode til betinget knockdown et mål protein uttrykk i voksen sebrafisk netthinnen er beskrevet, som innebærer intravitreally injisere antisens morpholinos og electroporating dem inn i netthinnen. Den resulterende protein er slått ned i flere dager, noe som gjør testing av protein rolle i regenerere eller intakt netthinne.

In vivo electroporation av Morpholinos til Adult sebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo electroporation av Morpholinos i Regenerating Adult sebrafisk Halefinner

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...