Name: in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina
Uploaded: 2011-12-27T12:00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

Författarna vill tacka de Freimann Life Science Center och Center for Zebrafish forskning personal för deras skötsel och underhåll av zebrafisk.

1. Morpholino förberedelser: <ol><li> Alla morpholino oligos bör vara skräddarsydda och beställde via GeneTools (Philomath, OR). Vi använder de positivt laddade betraktad som natriumjodid-märkta morpholinos att driva electroporated morpholinos mot den negativa elektroden. Vi försökte, utan framgång, att rikta negativt laddade fluorescein-märkta morpholinos till den positiva elektroden med denna teknik. Späd 300 nmol av morpholino till 100 ìl nukleasfritt vatten för att ge en 3 mm lösning. Alikvotera den morpholino i flera paraffin tillslutna mikrocentrifugrör. Förvaras åtskilt från ljus vid rumstemperatur. </li><li> Bestäm morpholino koncentration genom att späda 5 ìl morpholino (eller vatten som används för att späda ut morpholino som en tom) i 95 ìl av 0,1 N HCl. Ställ in spektrofotometern våglängd (λ) till 265 nm. Beräkna konstant för din morpholino hjälp av följande ekvation: Konstant = molekylvikt särskilt till din morpholino X 1000/molar absorbans. </li><li> Du hittar molekylvikt och molar uppgifter absorbansen på &quot;Oligo Egenskaper&quot; ark medföljer varje morpholino. Analysera det tomma för att verifiera baslinjen avläsningar och ta avläsningar av varje utspätt morpholino. Multiplicera absorbansen vid 265 nm för varje morpholino av sin bestäms konstant och med spädningsfaktorn för att få koncentrationen i ng / l. Dividera detta nummer av molekylvikten för att bestämma koncentrationen i mm. Späd morpholino vid behov till en fungerande koncentration. </li></ol> 2. Ta bort yttre hornhinnan skikt: <ol><li> Bedöva 6-12 månader gamla vuxna zebrafisk i Tricaine eller 2-fenoxietanol på 1,0 mg / ml i zebrafisk tank vatten. </li><li> Wrap zebrafisk i en fuktad bit hushållspapper, som täcker gälarna, men lämnar ögat exponeras. Den svepte fisken placeras under en stereoskopet och förstoringen ökas tills diametern på ögat fyller ungefär en tredjedel avsynfältet (Figur 1). </li><li> Använda Dumont # 5 pincett, ta den yttre hornhinnan nära synnerven spricka. Denna vävnad är färgad i rött och är märkt &quot;OC&quot; i figur 1. Det finns en liten utskjutning eller läpp som anges av pilen märkt &quot;CL&quot;. Dra på en låg vinkel (dvs. 10 grader) över ögat för att ta bort det yttre hornhinnan. Med lite övning kan detta fyllas i en rörelse. Om pincett slip, åter tag i vävnaden och återigen dra på en låg vinkel tills bort. En väl fäst hornhinnan kan orsaka ögat att rubbas ur uttaget när den dras. Du kan hålla ögat blir uttränges av stödjande med en annan uppsättning av pincett. </li></ol> 3. Hornhinnan snitt och morpholino injektion: <ol><li> Omedelbart efter avlägsnandet av det yttre hornhinnan, gör ett litet snitt i hornhinnan där eleven möter Iris (figur 2). Detta görs med en safir blad skalpell (se material). </li><li> Belastning 0,5 ìl av 3,0 mm morpholino lösningen i en Hamiltpå spruta försedd med en 33 gauge flyttbar, trubbig slut nål (se material). Pipettera upp och ner för att ta bort luftbubblor i raden. Försiktigt in nålen i glaskroppen genom snittet (Figur 2). Stick inte in nålen för långt eller du kommer att punktera näthinnan eller förskjuta linsen. </li><li> Injicera långsamt morpholino lösningen i vitreal rymden. Beroende på ålder fisken kommer vitreal utrymme hålla ~ 0,5 l. Du ska visualisera ofärgade glasartade läcker ut snittet som det är på flykt från morpholino lösningen. Spruta tills en liten mängd morpholino lösningen läcker ut från snittet. Du bör tydligt visualisera betraktad som natriumjodid-taggade morpholino inne i ögat. </li><li> Efter injektionen, återvänder fisken till tanken att återhämta sig. Vi brukar bara injicera vänster öga, med det högra ögat som en uninjected kontroll, men elektroporation på båda ögonen är möjlig. </li></ol> 4. Elektroporation: <ol><li> Efterinjektion av cirka 10 fiskar, nytt söva en injiceras fisk och linda in den i en fuktad bit hushållspapper, bara täcker gälarna, men lämnar ögat exponeras. Överför fisk till en petriskål. Sätt på latex eller liknande handskar för att undvika exponering av anestesi. Medan försiktigt håller fisken till botten av skålen, fyll skålen med anestesi (figur 3, till vänster). </li><li> En 3-mm-diameter platina platta elektroden (se Material) lokaliserar elektroporation pulser till ungefär hälften av näthinnan. Vi riktar vanligtvis rygg näthinnan. Tryck försiktigt positiva elektroden nedåt på ventrala delen av ögat. Med den yttre hornhinnan bort, är ögat roteras lätt, utsätta rygg delen av ögongloben. </li><li> Samtidigt som du trycker ner på den ventrala sidan av ögat, placera den negativa elektroden nära (~ 1 - 2 mm) de exponerade rygg hälften av ögat. Var noga med att inte röra den negativa elektroden direkt till ögat, vilket kommer att resultera i skadligaryggens näthinnan. När du bestämma lämpligt avstånd mellan elektroderna, använd justerskruven på handtaget av elektroderna att hävda att spridas när electroporating. Detta håller den negativa elektroden ett optimalt avstånd från ögongloben när den positiva elektroden pressas ner i position. </li><li> Electroporate ögat med hjälp av en CUY21 Square Wave Electroporator (se material). Den elektroporation parametrar ska ställas in på två på varandra följande 50-ms pulser, vid 75 V med en 1-sek paus mellan pulser. </li><li> Återgå fisk till tanken. Vi startar normalt våra protokoll för konstant ljusinducerad näthinnedegeneration omedelbart efter elektroporation. </li></ol> 5. Representativa resultat: <ol><li> För 3-5 dagar efter elektroporation (beroende på stabiliteten i morpholino) kan betraktad som natriumjodid etiketten visualiseras i alla näthinnans lager i en delad näthinnan (Figur 4). Detta fungerar som en bekräftelse för förekomst avden märkta morpholino. </li><li> Vi kan uppnå full protein ÖVERVÄLDIGANDE upp till 3-5 dagar efter elektroporation, beroende på effekten av de morpholino (Figur 5). Vanligtvis under ljusbehandlingen studier skördar vi ögonen på 3 eller 4 dagar efter morpholino elektroporation. Detta görs genom att ta bort hela ögat med Dumont # 5B pincett med runda hörn (Figur 6, material) och bearbetning av vävnad för immunohistokemi 15. Som med alla ÖVERVÄLDIGANDE teknik, måste en demonstration av effektiv knockdown att visas för att validera den fenotypen. Därför föreslår vi att få antiserum för ditt protein av intresse. Alternativt, om och antikroppar är inte tillgänglig och morpholino riktas till antingen skarva acceptanten eller tagstället i pre-mRNA, kommer det att blockera effektiv skarvning av mRNA. I detta fall är det möjligt att använda omvänt transkriptas-PCR för att förstärka de flankerande sekvenser i morphant RNA och bestämma effektiviteten i att blockera den normala skarvning mönster. </li><li> När näthinnor sektioneras från näsan till temporala på rygg-ventrala axeln, det skuggade blå rutor (Figur 6) representerar områden av näthinnan som oftast skadas från elektroporation själva evenemanget. De skuggade rosa ruta är den yta som är riktad till morpholino införande i näthinnans celler genom elektroporation. </li></ol><img alt="Figur 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> Figur 1. Schematisk skildrar avlägsnande av epitelceller lager av hornhinnan. Den vänstra panelen visar de stora strukturella drag i ögat, inklusive linsen (L), glaskroppen (Vit), näthinnan (R), den yttre hornhinnan (OC), den inre hornhinnan (IC) och hornhinnan utstick ( CL). Inriktningen i ögat visas i nedre högra hörnet av den första panelen och är märkt främre (A), bakre (P), bröst (D) och ventrala (V). Den röda färgen indikerar yttre hornhinnan som tas bort. Den andra pannan<html> el visar hur peang används för att ta tag i hornhinnan utstick och dra den yttre hornhinnan i ögat på en låg vinkel (tredje panelen). Den högra panelen visar hur en andra pincett kan användas för att stabilisera ögat samtidigt dra hornhinnan. <img alt="Figur 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> Figur 2. Schematisk av stegen i intravitreal injektion av morpholino. Ett litet snitt görs i ögat där eleven möter Iris (till vänster). Den resulterande skillnaden bör vara precis tillräckligt stor för en 33 gauge kanyl, som är fylld med morpholino lösningen, som ska infogas (mitten panelen). Injicera långsamt 0,5 l lösning i glaskroppen (högra panelen). Du ska visualisera en liten mängd vitreal lösning komma ut ur snittet eftersom glaskroppen är delvis ersatts av med betraktad som natriumjodid-märkta morpholino (högra panelen). ig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3. Schematisk av den allmänna elektroporation förfarande. Den sövda fisk, som intravitreally injicerades med morpholino, är försiktigt insvept i fuktig pappershandduk (till vänster). Den pappershandduk bör omfatta gälarna, men inte hindra ögat (mitten panelen). Tryck försiktigt positiva elektroden ner på den ventrala delen av ögat, vilket gör att rygg halva ögat att rotera ur uttaget. Placera den negativa elektroden ca 1 mm från dorsala delen av ögat och starta elektroporation (högra panelen). <img alt="Figur 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> Figur 4. Confocal bilden jämföra en näthinna electroporated utan intravitreally injicera en betraktad som natriumjodid-märkta morpholino (A), och en näthinnan intravitreally injiceras och electroporated med betraktad som natriumjodid-märkta morpholino (B). Den betraktad som natriumjodid Etiketten finns i alla näthinnan lager och celltyper. ROS, Rod yttresegment, ENDA, yttre kärnlagret, INL, inre nukleära lagret, GCL, ganglion cellager. <img alt="Figur 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> Figur 5. Confocal bilder jämföra PCNA immunolocalization i näthinnor electroporated med en kontrollgrupp morpholino (vänster paneler) och näthinnor electroporated med en anti-PCNA morpholino (höger sida) före ljusinducerad fotoreceptor celldöd. Dark-anpassad vuxen albino zebrafisk placerades i ständig intensivt ljus för 1, 2 eller 3 dagar efter elektroporering av morpholino. Kontrollen morpholino misslyckats med att förtränga allt PCNA uttryck i ljus-skadade näthinnor. Den anti-PCNA morpholino knackade effektivt ner PCNA protein uttryck genom tre dagar av konstant intensivt ljus skador. <img alt="Figur 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> Figur 6. Schematisk (till vänster) visar enucleation i ögat för processing och cryosectioning, vilket görs längs ryggens ventrala axeln. Den rosa skuggad ruta (höger panel) visar näthinnans regionen med den största mängden protein ÖVERVÄLDIGANDE med denna teknik. De blå skuggade rutorna representerar områden som oftast skadas av elektroporation händelsen. Inriktningen i ögat är märkt främre (A), bakre (P), bröst (D) och ventrala (V).

<ol>
	<li>Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proneural+basic+helix-loop-helix+gene+ascl1a+is+required+for+retina+regeneration.">The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).</li><li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+inner+retinal+neurons+after+intravitreal+injection+of+ouabain+in+zebrafish.">Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li><li>Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+injury-induced+neurogenesis+in+the+vertebrate+retina.">Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-+and+dose-dependent+influence+of+ouabain+on+the+ultrastructure+of+optic+neurones.">Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones.</a> Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).</li><li>Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cones+regenerate+from+retinal+stem+cells+sequestered+in+the+inner+nuclear+layer+of+adult+goldfish+retina.">Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).</li><li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Muller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish.">Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li><li>Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regional+differences+in+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+light-lesioned+albino+zebrafish.">Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish.</a> Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).</li><li>Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish.">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antisense+inhibitor+of+MMP-9+attenuates+angiogenesis,+human+prostate+cancer+cell+invasion+and+tumorigenicity.">A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity.</a> Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Muller+glia+and+neuronal+progenitors+during+adult+zebrafish+retinal+regeneration.">Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration.</a> Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).</li><li>Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+intact+and+regenerating+zebrafish+retina.">Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina.</a> Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).</li><li>Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+galectin+Drgal1-l2+is+expressed+by+proliferating+Muller+glia+and+photoreceptor+progenitors+and+regulates+the+regeneration+of+rod+photoreceptors.">The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).</li><li>Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6a+and+Pax6b+are+required+at+different+points+in+neuronal+progenitor+cell+proliferation+during+zebrafish+photoreceptor+regeneration.">Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration.</a> Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+glial+cell+division+blocks+regeneration+of+the+light-damaged+zebrafish+retina.">Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina.</a> Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).</li></ol>

Vi har inget att lämna ut

Nyligen undersökte två microarray analyser de förändringar genuttryck som inträffade under förnyelse av antingen ljus-skadade näthinnan eller ett kirurgiskt exciderad retinal plåster 10, 16. Båda studierna visade många gener som uppvisade betydande förändringar i uttryck, antingen öka eller minska, som sannolikt krävs för olika händelser som inträffar under retinal förnyelse, såsom återinförsel av Müller Glia i cellcykeln, fortsatt spridning och migration av neuronala stamceller till den skadade näthinnan lager, och differentieringen av neuronala stamceller i rätt neuronal celltyp. Medan en direkt jämförelse av dessa två microarray datamängder avslöja gener som kan vara inblandade i dessa cellulära händelser i slutändan dessa gener och deras kodade proteinerna måste testas för att avgöra om de är nödvändiga för neuronal regeneration. Här beskriver vi en kraftfull förlust-of-funktion inställning till conditiointernt ÖVERVÄLDIGANDE proteiner av intresse för den vuxna zebrafisk näthinnan. Denna teknik har använts för att studera både till extracellulära och intracellulära proteiner, liksom signalmolekyler, faktorer transkription och proteiner som behövs för DNA-replikation 17-19. Därför har denna metod hjälpt mycket vår förståelse av de molekylära mekanismen bakom vuxna retinal förnyelse i zebrafisk. Vi testade flera elektroporation parametrar (spänning, antal pulser, tiden mellan pulserna) innan en lyckad protokoll uppnåddes. En tidigare rapport från electroporating morpholinos i regenererande zebrafisk stjärtfenan användes 10 pulser vid låg spänning (15 V) 20. Eftersom vuxna zebrafisk näthinnan är omgiven av flera cellager och inte är lättillgängliga för pincett elektroder, var de parametrar som används i fin misslyckade på ett effektivt electroporating morpholinos i vuxen näthinnan. Omvänt kan en hög spänning (100 V) res oftaulted i döden för fisken. Nyligen V 5 pulser av 80 beskrevs att electroporate plasmid DNA i det nyfödda musen valpen näthinnan 21. Vi fann att en något mindre intensiv 2 pulser på 75 V resulterat i en framgångsrik elektroporering av morpholinos i vuxen zebrafisk näthinnan med överlevnaden för 100% av de behandlade fisk. Dessutom upptäckte vi att avlägsnandet av det yttre mest (eller yttre flesta) komponenten av hornhinnan kraftigt ökade elektroporation effektivitet. Öka antalet pulser kan eliminera behovet för borttagning av denna vävnad men kan också orsaka ökad vävnadsskada. Omfattande kontroll studier har visat att dessa parametrar inte orsakade några större näthinnan celldöd eller ändra det specifika cellulära svaren observerats under fotoreceptor regeneration 19. Gain-of-funktion studier är för närvarande inte möjligt att använda denna teknik in vivo, på grund av vår oförmåga att konsekvent electroporate stora ribonucleic syror i alla retinal celler. Tyder dock på framgång electroporating plasmider i musen näthinnan in vivo och zebrafisk näthinnan i explants är det fortfarande en möjlighet i zebrafisk 21, 22. En av styrkorna med denna teknik är det elektroporation verkar för att effektivt införa morpholino i alla de olika retinala celltyper. Var dock en potentiell svaghet att elektroporation effektivt levererat morpholino in bara rygg och centrala näthinnans regioner. En andra elektroporation händelsen mot ventrala delen av näthinnan ger god inriktning för att alla lager, men leder ofta till skador. Den geografiska begränsningen var sannolikt på grund av formen och placeringen av elektroderna. Användningen av kundanpassade kopp formade elektroder som kan placeras runt ögat kan förbättra denna svaghet. Denna rumsliga begränsning av morpholino leverans begränsar användningen av denna teknik och utesluter användning av en analys framgångsrikah som ERG analys som skulle kräva en helhetsbedömning av näthinnan. Det bör noteras att som med alla morpholino experiment, är det lämpligt att bekräfta dina resultat med hjälp av en andra, icke-överlappande morpholino till målet mRNA. I vissa fall är det möjligt att också electroporate två olika morpholinos samtidigt för att ÖVERVÄLDIGANDE uttrycket av två olika proteiner. Vi visar detta genom att knacka ner ett uttryck för både Pax6a och Pax6b proteiner, enskilt och i kombination 18. Även om vi visade att använda denna teknik med vårt ljus skador modell, skulle det sannolikt användas för att studera förnyelse i andra skador modeller 2-8 eller användas för att undersöka funktionen hos proteiner i oskadat näthinnan. Till exempel kan elektroporation av morpholinos användas för att ÖVERVÄLDIGANDE uttrycket av specifika kanaler eller signalmolekyler transduktion i ganglion eller amakrina celler och sedan studera funktionen av dessa signaleringvägar i visuell bearbetning. Eftersom morpholinos bara påverkar översättningen av nya proteiner, skulle man vänta tills endogena proteinomsättningen inträffar före en analys kunde utföras. Beroende på stabilitet av proteinet kunde allt från timmar till dagar 18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT eller CUY21-SC Fyrkantsvåg electroporator </td><td> Protech International </td><td> CUY21EDIT eller CUY21SC </td><td> Båda enheterna arbetar för detta protokoll </td></tr><tr><td> 3-mm diameter paddla elektroder </td><td> Protech International </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino bör vara anpassade för att ditt protein av intresse </td></tr><tr><td> 2-Phenoxyethanol </td><td> Sigma </td><td> 77.861-1L </td><td> Anestesi, späd 1:1000 i fisk systemet vatten förfarande, 1:500 för dödshjälp </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pincett </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td>14.095 </td><td> Alla # 5 pincett med arbete </td></tr><tr><td> Dumont # 5B pincett med vinklad tips </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> 500.234 </td><td> Används för att enucleate ögat efter dödshjälp </td></tr><tr><td> Sapphire blad, dubbel kant lans, 1 mm brett, med Sapphire kniv handtag </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> Blade: 500.314 Handtag: 500.317 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton spruta med löstagbara 33 gauge trubbig slut nål </td><td> Hamilton företag </td><td> Spruta: 87.930 Nål: 7762-06 </td><td> Ta bort nål som kommer med spruta och ersätt med 33-gauge trubbig slut nål </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Många förödande ärftliga ögonsjukdomar resultera i progressiv och irreversibel blindhet eftersom människor inte kan regenerera döende eller sjuka näthinnan nervceller. Däremot har de vuxna zebrafisk näthinnan den robusta förmågan att spontant regenerera någon neuronala klass som är vilse i en mängd olika skada på näthinnan modeller, inklusive retinal punktera, kemiska ablation, koncentrerad hög temperatur, och intensiv ljusbehandling 1-8. Vårt labb kännetecknas omfattande förnyelse av fotoreceptorer efter ständig intensiv ljusbehandling och inre näthinnan nervceller efter intravitreal ouabain injektion 2, 5, 9. I samtliga fall bosatt Müller Glia tillbaka in i cellcykeln för att producera neuronala stamceller, vilka fortsätter att föröka sig och migrera till rätt näthinnans skikt, där de differentieras till de bristfälliga nervceller. Vi kännetecknas fem olika steg under regenerering av ljus-damaGED näthinnan som lyftes fram av specifika cellulära svaren. Vi identifierade flera differentiellt uttryckta gener i varje skede av retinal förnyelse av mRNA microarray analys 10. Många av dessa gener är också avgörande för okulär utveckling. För att testa den roll som varje kandidat gen / protein under retinal föryngring, behövde vi utveckla en metod för att villkorligt begränsa uttrycket för en kandidat protein endast vid sådana tidpunkter under regenerering av den vuxna näthinnan. Morpholino oligos används ofta för att studera förlust av funktion av specifika proteiner under utvecklingen av zebrafisk, Xenopus, kyckling, mus och tumörer i mänskliga xenografter 11-14. Dessa modifierade oligos basepair med kompletterande RNA-sekvens att antingen blockera skarvning eller översättning av target RNA. Morpholinos är stabila i cellen och kan eliminera eller &quot;knockdown&quot; protein uttryck för tre till fem dagar 12. Härvi beskriver en metod för att effektivt ÖVERVÄLDIGANDE målprotein uttryck i den vuxna zebrafisk näthinnan. Denna metod använder betraktad som natriumjodid-märkta antisens morpholinos som injiceras i glaskroppen av den vuxna zebrafisk ögat. Använda elektrod pincett är morpholino sedan electroporated i alla celltyper i rygg och centrala näthinnan. Lissamin ger avgift på morpholino för elektroporation och kan visualiseras för att bedöma förekomsten av morpholino i näthinnans celler. Villkorad ÖVERVÄLDIGANDE i näthinnan kan användas för att undersöka betydelsen av specifika proteiner vid olika tidpunkter under regeneration. Dessutom kan denna metod användas för att studera betydelsen av specifika proteiner i oskadat näthinnan, i processer som visuella transduktion och visuell bearbetning i andra ordningens neuron.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

En metod för att villkorligt ÖVERVÄLDIGANDE ett målprotein uttryck i den vuxna zebrafisk näthinnan beskrivs, som innebär intravitreally injicera antisense morpholinos och electroporating dem i näthinnan. Den resulterande protein är knockad i flera dagar, vilket gör att testa proteinets roll i regenererande eller intakt näthinnan.

In vivo elektroporering av Morpholinos i Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplantation av hela Njure Marrow i vuxen Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic kultur Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single Cell elektroporation in vivo i den intakta växande hjärnan

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Retro-orbital injektionsvätska till vuxna Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissektion av organ från vuxna Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneal injektion i vuxen Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

Direkt Leverans av MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst med injektion och elektroporation Påverkar Inner Ear utveckling

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Transplantation av celler direkt in i njuren för vuxna Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissekering av vuxna Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Elektroporering av Morpholinos i Regenerating Adult Zebrafish stjärtfenan

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...