Name: application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Vi takker UAMS Proteomikk Facility for massespektrometrisk støtte. Midler til dette prosjektet ble gitt av NIH tilskudd P20RR015569, P20RR016460 og R01DA025755.

Denne protokollen er endret fra Blair et al. 6. 1. LSD1 demetylering Assay <ol><li> I en endelig volum på 20 mL, kombinere 125 ng rekombinant LSD1 med 0,25 mg di-methyl histone H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) i demethylase buffer (50 mM Tris-Cl 8,5 pH, 50 mM KCl, 5 mm MgCl 2, 5% glyserol). I tillegg utfører et peptid alene kontroll uten enzym. Kontrollen er for seksjon 3 og trenger ikke reduktiv metylering. </li><li> Inkuber i 2 timer ved 37 °...

<ol>
	<li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+a+landscape+takes+shape.">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+(KDM5)+Enzymes+in+Cancer.">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li><li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes.">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li><li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MassSQUIRM:+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity.">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li><li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1:+a+molecular+motor.">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li><li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling.">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li><li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression.">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li><li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs.">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li></ol>

MassSQUIRM er en billig og kvantitativ metode for helhetlig analyse av aktiviteten til lysin demethylases involvert i mono-og di-metylering. MassSQUIRM tilbyr kvantifisering ikke bare av produktet av reaksjonen, men også for mellomprodukter. Denne analysen kan brukes som et kraftig verktøy i å studere mekanismen av LSD1 og andre histone demethylases. Det vil også være nyttig for å klassifisere mange nyoppdagede lysin demethylase enzymer som PHF8 og kan brukes til visse metyltransferase enzymer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS biovitenskap </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-biotin peptid </td><td> utarbeidet i-huset </td><td> none </td></tr><tr><td> POROS R2 20 mikron perler </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic syre (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> acetonitril </td><td> Fisher </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-dihydroxybenzoic syre </td><td> Sigma </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Borane dimetylamin </td><td> Sigma </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> isotopically tung d 2-formaldehyd </td><td> Cambridge isotoplaboratorier </td&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Fisher </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fisher </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Glyserol </td><td> Fisher </td><td> G33 </td></tr><tr><td> Maursyre </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Na-fosfat </td><td> Fisher </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac Konsentratoren </td><td> Savant </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF massespektrometer og TOFworks programvare </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> none </td></tr></tbody></table>

application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity

Nylig har epigenetic regulatorer blitt oppdaget som sentrale aktører i mange ulike sykdommer 1-3. Som et resultat av disse enzymene er førsteklasses mål for lite molekyl studier og legemiddelutvikling 4. Mange epigenetic regulatorer har bare nylig blitt oppdaget og er fortsatt i ferd med å bli klassifisert. Blant disse enzymene er lysin demethylases som fjerner metylgrupper fra lysines på histoner og andre proteiner. På grunn av romanen karakter av denne klassen enzymer, er det få analyser er utviklet for å studere deres aktivitet. Dette har vært en veisperring til både klassifisering og høy gjennomstrømning studie av histone demethylases. Foreløpig svært få demethylase analyser foreligger. De som gjør eksisterer tendens til å være kvalitativ i naturen og kan ikke samtidig skjelne mellom de forskjellige lysin metylering tilstander (un-, mono-, di-og tri-). Massespektrometri er vanlig å bestemme demethylase aktivitet men dagens massespektrometrisk analyser doikke ta om differensielt denaturert peptider ionisere annerledes. Differensiert ionisering av denaturert peptider gjør sammenligne metylering stater vanskelig og slett ikke kvantitativ (figur 1A). Dermed tilgjengelige analysene ikke er optimalisert for omfattende analyse av demethylase aktivitet. Her beskriver vi en metode som kalles MassSQUIRM (massespektrometrisk kvantifisering ved hjelp av isotoper reduktive metylering) som er basert på reduktive metylering av aminer grupper med deuterert formaldehyd å tvinge alle lysines å være di-denaturert, og dermed gjør dem i hovedsak de samme kjemiske stoffer og derfor ionisere samme (Figur 1B). Den eneste kjemiske forskjellen etter reduktiv metylering er hydrogen og deuterium, som ikke påvirker MALDI ionisering effektivitet. Den MassSQUIRM analysen er spesifikk for demethylase reaksjonsprodukter med un-, mono-eller di-denaturert lysines. Analysen er også aktuelt å lysin methyltransferases gir SAmeg reaksjonsprodukter. Her bruker vi en kombinasjon av reduktiv metylering kjemi og MALDI massespektrometri å måle aktiviteten til LSD1, en ​​lysin demethylase stand til å fjerne di-og mono-metylgrupper, på en syntetisk peptid substrat 5. Denne analysen er enkel og lett mottakelig for noen lab med tilgang til en MALDI massespektrometer i laboratoriet eller gjennom en proteomikk anlegget. Analysen har ~ 8-fold dynamisk rekkevidde og er lett skalerbar til plate-format fem.

Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Vi presenterer en metode for å bruke MALDI massespektrometri og reduktive metylering kjemi å kvantifisere endringer i lysin metylering.

Anvendelse av MassSQUIRM for kvantitative målinger av Lysine demethylase aktivitet

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Kvantitativ, Real-time analyse av Base Excision Reparasjon aktivitet i Cell lysates utnytte Lesjon-spesifikke Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

Analysere og bygningsloven Nukleinsyre Structures med 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosolisk Kalsium Målinger i nyre Epitelceller med flowcytometri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Spesifisitet Analyse av Protein Lysin metyltransferaser hjelp SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funksjonell tilberedning og Channel Aktivitet Målinger av Renset villtype og Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Utvikling og karakterisering av<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvessel Nettverk og kvantitative målinger av endotel [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Og nitrogenoksid produksjon

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Anvendelse av elektrofysiologi mål å studere aktiviteten til elektro-nøytral transportører

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifisering av områdespesifikke Protein lysin Acetylation og Succinylation støkiometri ved hjelp av Data-uavhengig oppkjøpet massespektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...