Name: application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Agradecemos ao UAMS Facilidade Proteomics de apoio por espectrometria de massa. O financiamento para este projeto foi fornecido pelo NIH concede P20RR015569, P20RR016460 e R01DA025755.

Este protocolo é modificado a partir de Blair et al. 6. 1. LSD1 Ensaio desmetilação <ol><li> Em um volume final de 20 uL, combinar 125 ng LSD1 recombinante com 0,25 ug de di-metil histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) em tampão de desmetilase (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM de KCl, 5 mM MgCl2, 5% glicerol). Além disso, realizar um péptido de controlo sozinha, sem enzima. O controle é para a secção 3 e não precisa de metilação reduti...

<ol>
	<li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+a+landscape+takes+shape.">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+(KDM5)+Enzymes+in+Cancer.">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li><li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes.">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li><li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MassSQUIRM:+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity.">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li><li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1:+a+molecular+motor.">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li><li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling.">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li><li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression.">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li><li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs.">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li></ol>

MassSQUIRM é um método barato e quantitativa para análise abrangente da atividade de demethylases lisina envolvidas na mono-e di-metilação. MassSQUIRM oferece não só a quantificação do produto da reacção, mas também para os intermediários. Este ensaio pode ser utilizado como uma ferramenta poderosa para estudar o mecanismo de LSD1 e outros demethylases histona. Também irá ser útil para a classificação de muitas enzimas recém-descobertas desmetilase de lisina, tais como PHF8 e poderiam ser usados ​?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biosciences </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-biotina péptido </td><td> preparada em casa </td><td> nenhum </td></tr><tr><td> POROS R2 20 esferas de micro </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> acetonitrila </td><td> Pescador </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-di-hidroxibenzóico </td><td> Sigma </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Borano dimetilamina </td><td> Sigma </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> isotopicamente pesado d 2-formaldeído </td><td> Cambridge Isotope Laboratories </td&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Pescador </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Pescador </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Pescador </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> G33 </td></tr><tr><td> O ácido fórmico </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Pescador </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Na-fosfato </td><td> Pescador </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> Concentrador Speedvac </td><td> Sábio </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF espectrômetro de massa e TOFworks software </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> nenhum </td></tr></tbody></table>

application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity

Recentemente, os reguladores epigenéticos têm sido descobertos como atores-chave em muitos diferentes doenças 1-3. Como resultado, estas enzimas são alvos principais para os estudos de moléculas pequenas e 4 desenvolvimento de drogas. Muitos reguladores epigenéticos têm apenas recentemente descobertos e ainda estão em vias de ser classificado. Entre estas enzimas são demethylases lisina que removem grupos metilo a partir de lisinas na histonas e outras proteínas. Devido à natureza novo desta classe de enzimas, ensaios de poucos têm sido desenvolvidos para estudar a sua actividade. Este tem sido um bloqueio na estrada para tanto a classificação e estudo de alto rendimento de demethylases histonas. Atualmente, ensaios demetilase existem poucos. As que existem tendem a ser de natureza qualitativa e não pode discernir entre simultaneamente os diferentes estados de metilação de lisina (un-, mono-, di-e tri-). Espectrometria de massa é comumente usado para determinar a atividade demetilase mas atuais ensaios de espectrometria de massa donão dirigir se peptídeos diferencialmente metilados ionizar de forma diferente. Ionização diferencial de péptidos metilados faz comparando estados de metilação difícil e certamente não quantitativa (Figura 1A). Assim, os ensaios disponíveis não são otimizados para a análise global da atividade demetilase. Descrevemos aqui um método chamado MassSQUIRM (quantificação por espectrometria de massa utilizando metilação redutiva isotópica) que é baseado em metilação redutiva de grupos amina com formaldeído deuterado para forçar todos os lisinas ser di-metilado, tornando-as assim essencialmente os mesmos espécies químicas e, portanto, ionizar o mesmo (Figura 1B). A diferença química apenas após a metilação redutiva é hidrogénio e deutério, que não afecta a eficiência de ionização MALDI. O ensaio MassSQUIRM é específico para produtos de reacção desmetilase com lisinas un-, mono-ou di-metilados. O ensaio é também aplicável a metiltransferases lisina dando o same produtos de reacção. Aqui, nós usar uma combinação de química metilação redutiva e espectrometria de massa MALDI para medir a actividade de LSD1, um desmetilase lisina capaz de remover di-e mono-metilo grupos, sobre um substrato de péptido sintético 5. Este ensaio é simples e facilmente acessíveis a qualquer laboratório com acesso a um espectrómetro de massa MALDI em laboratório ou através de um mecanismo proteômica. O ensaio tem ~ gama de 8 vezes dinâmico e é prontamente adaptar ao formato de placa 5.

Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Apresentamos um método para o uso de espectrometria de massa MALDI e química metilação redutiva para quantificar as mudanças na metilação da lisina.

Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biologia

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

Análise e construção de estruturas de Ácido Nucleico com 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Medidas cálcio citosólico em células epiteliais renais por citometria de fluxo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Desenvolvimento e Caracterização de<em&gt; In Vitro</em&gt; Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E óxido nítrico Produção

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Quantificação de Estoicometria de Acetilação e Succinilação de Lisinas Proteicas em Sítios Específicos Usando Espectrometria de Massa de Aquisição de Dados Independente

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...