Name: application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Мы благодарим фонд UAMS протеомики для масс-спектрометрического поддержки. Финансирование этого проекта было предоставлено грантов NIH P20RR015569, P20RR016460 и R01DA025755.

Этот протокол изменяется от Блэра и соавт. 6. 1. LSD1 Деметилирование Пробирной <ol><li> В конечном объеме 20 мкл, объединить 125 нг рекомбинантного LSD1 с 0,25 мкг ди-метил гистона H3 пептида (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-биотин) в буфере деметилазы (50 мМ Трис-Cl рН 8,5, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, 5% ?...

<ol>
	<li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+a+landscape+takes+shape.">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+(KDM5)+Enzymes+in+Cancer.">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li><li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes.">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li><li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MassSQUIRM:+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity.">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li><li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1:+a+molecular+motor.">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li><li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling.">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li><li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression.">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li><li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs.">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li></ol>

MassSQUIRM является недорогим и количественных методов для всестороннего анализа деятельности лизин деметилаз участие в моно-и ди-метилирования. MassSQUIRM предлагает количественного не только продукт реакции, но и для промежуточных. Этот анализ может быть использован как мощный инструмент в ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> БПС Biosciences </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-биотин пептид </td><td> подготовлен в доме </td><td> никто </td></tr><tr><td> ПОРОС R2 20 микрон бисера </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Трифторуксусной кислоты (ТФК) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> ацетонитрил </td><td> Рыбак </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-диоксибензойной кислоты </td><td> Сигма </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Боран диметиламин </td><td> Сигма </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> изотопно тяжелой D 2-формальдегидные </td><td> Кембридж изотопных лабораторий </tг&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> Трис </td><td> Рыбак </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Рыбак </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Рыбак </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Глицерин </td><td> Рыбак </td><td> G33 </td></tr><tr><td> Муравьиная кислота </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> Метанол </td><td> Рыбак </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Na-фосфат </td><td> Рыбак </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac концентратор </td><td> Ученый </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-масс-спектрометр prOTOF и TOFworks программного обеспечения </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> никто </td></tr></tbody></table>

application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity

В последнее время эпигенетические регуляторы были обнаружены играть ключевую роль в самых различных заболеваний 1-3. В результате, эти ферменты являются главными целями для небольших исследований молекулы и 4 разработки лекарственных препаратов. Многие эпигенетические регуляторы только недавно были обнаружены и до сих пор в процессе классификации. Среди этих ферментов лизин деметилаз которые удаляют из метильных групп лизина на гистонов и других белков. В связи с новым характером этого класса ферментов, несколько анализов были разработаны с целью изучения их деятельности. Это был дорогой блок как классификация и высокой пропускной способностью исследования гистонов деметилаз. В настоящее время очень мало тестов деметилазы существует. Те, которые действительно существуют, как правило, качественный характер и не может одновременно различать между различными государствами метилирование лизина (не-, моно-, ди-и три-). Масс-спектрометрия широко используется для определения деметилазы деятельности, но текущий масс-спектрометрических анализов делатьне затрагивает ли дифференциально метилированные пептидов ионизируют по-разному. Дифференциальная ионизации метилированных пептидов делает сравнение метилирования государства трудно и, конечно, не количественный (рис. 1А). Таким образом, доступные анализы не были оптимизированы для всестороннего анализа деметилазы деятельности. Здесь мы опишем метод MassSQUIRM (масс-спектрометрического количественного использовании изотопных восстановительного метилирования), который основан на редуктивных метилирование аминогрупп с дейтерированных формальдегид, чтобы заставить всех лизинов быть ди-метиловым, что делает их по существу и того же вида химической ионизации и, следовательно, же (рис. 1б). Разница лишь в химической после восстановительного метилирования водорода и дейтерия, которая не влияет на эффективность MALDI ионизации. Анализ MassSQUIRM является специфическим для деметилазы продуктов реакции с не-, моно-или ди-метилированных лизина. Анализ также применим к лизин метилтрансферазы давая SAМеня продуктов реакции. Здесь мы используем сочетание восстановительной химии метилирования и MALDI масс-спектрометрии для измерения активности LSD1, лизин деметилазы способен удалять ди-и моно-метильных групп, на синтетической подложке пептид 5. Этот тест является простым и легко поддаются любой лаборатории, имеющие доступ к спектрометр MALDI масс в лаборатории или через средства протеомики. Анализ имеет ~ 8-кратный динамический диапазон и легко масштабируемой, чтобы пластины формата 5.

Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Мы представляем способ использования MALDI масс-спектрометрии и восстановительной химии метилирования количественного изменения в лизин метилирования.

Применение MassSQUIRM для количественного измерения Лизин активность деметилазы

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Тест для измерения активности Кишечной палочки Индуцибельной Лизин Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Количественные, в режиме реального времени анализ базы активность репарации в клеточных лизатов Использование Поражение конкретные молекулярные маяки

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

Анализ и построение структуры нуклеиновых кислот с 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Цитозольные Измерения кальция в почечных эпителиальных клеток методом проточной цитометрии

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Специфика анализа белковых лизина метилтрансферазы Использование SPOT пептидов массивов

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Функциональная Реорганизация и активности канала измерения очищенной дикого типа и мутантных CFTR белка

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Разработка и определение характеристик<em&gt; In Vitro</em&gt; Микрососудов Сеть и количественные измерения эндотелиальной [Са<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; я</sub&gt; И оксид азота Производство

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Применение измерений электрофизиологии для изучения деятельности перевозчиков электро нейтральный

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Количественная оценка конкретных участков белка лизин ацетилирования и стехиометрии Succinylation с помощью приобретения данных независимые масс-спектрометрия

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...