Name: application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Damos las gracias al Fondo para UAMS Proteómica para el apoyo de espectrometría de masas. Los fondos para este proyecto fue proporcionado por el NIH subvenciones P20RR015569, P20RR016460 y R01DA025755.

Este protocolo se ha modificado de Blair et al. 6. 1. LSD1 desmetilación Ensayo <ol><li> En un volumen final de 20 l, se combinan 125 LSD1 recombinante ng con 0,25 g de di-metilo histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) en tampón desmetilasa (50 mM Tris-Cl, pH 8,5, KCl 50 mM, 5 mM de MgCl 2, 5% glicerol). Además, realizar un control de péptido solo sin enzima. El control es de la sección 3 y no necesita la metilación reductiva. </li><li> ...

<ol>
	<li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+a+landscape+takes+shape.">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+(KDM5)+Enzymes+in+Cancer.">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li><li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes.">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li><li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MassSQUIRM:+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity.">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li><li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1:+a+molecular+motor.">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li><li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling.">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li><li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression.">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li><li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs.">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li></ol>

MassSQUIRM es un método económico y cuantitativo para el análisis integral de la actividad de la lisina desmetilasas involucrados en mono-y di-metilación. MassSQUIRM ofrece cuantificación no sólo del producto de la reacción, sino también para los productos intermedios. Este ensayo se puede utilizar como una poderosa herramienta en el estudio del mecanismo de desmetilasas histonas LSD1 y otros. También será útil para la clasificación de muchos recién descubiertos enzimas desmetilasa lisina como PHF8 y podrí...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biociencias </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-biotina péptido </td><td> Elaboración propia </td><td> ninguno </td></tr><tr><td> Poros R2 20 micras cuentas </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> acetonitrilo </td><td> Pescador </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-dihidroxibenzoico ácido </td><td> Sigma </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Borano de dimetilamina </td><td> Sigma </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> isotópicamente pesada d 2-formaldehído </td><td> Cambridge Laboratorios de isótopos </td&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Pescador </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Pescador </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Pescador </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Pescador </td><td> G-33 </td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> El metanol </td><td> Pescador </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Fosfato de Na </td><td> Pescador </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac Concentrador </td><td> Sabio </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF espectrómetro de masas y el software TOFworks </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> ninguno </td></tr></tbody></table>

application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity

Recientemente, los reguladores epigenéticos se han descubierto como actores clave en muchas enfermedades diferentes 1-3. Como resultado, estas enzimas son los principales objetivos para los estudios de moléculas pequeñas y 4 desarrollo de fármacos. Muchos reguladores epigenéticos sólo recientemente se han descubierto y todavía están en proceso de ser clasificados. Entre estas enzimas son desmetilasas lisina que eliminan los grupos metilo de lisinas de las histonas y otras proteínas. Debido a la naturaleza novedosa de esta clase de enzimas, ensayos de pocos se han desarrollado para estudiar su actividad. Este ha sido un obstáculo en el camino tanto para la clasificación y el estudio de alto rendimiento de desmetilasas histonas. Actualmente, los ensayos desmetilasa existen muy pocos. Las que existen tienden a ser de naturaleza cualitativa y no se puede al mismo tiempo discernir entre los estados de metilación de lisina diferentes (un-, mono-, di-y tri-). La espectrometría de masas se utiliza comúnmente para determinar la actividad desmetilasa pero los ensayos actuales de espectrometría de masasno abordar si péptidos diferencialmente metilado ionizar diferente. Ionización diferencial de péptidos metilado hace comparando los estados de metilación difícil y ciertamente no cuantitativa (Figura 1A). Así, los ensayos disponibles no están optimizados para el análisis integral de la actividad desmetilasa. Aquí se describe un método llamado MassSQUIRM (cuantificación de espectrometría de masas utilizando metilación reductiva isotópica) que se basa en la metilación reductiva de grupos amina con formaldehído deuterado para forzar a todos lisinas ser di-metilado, lo que les hace esencialmente las mismas especies químicas y por lo tanto ionizar el misma (Figura 1B). La única diferencia química después de la metilación reductiva es hidrógeno y deuterio, que no afecta a la eficiencia de ionización MALDI. El ensayo MassSQUIRM es específico para los productos de reacción con desmetilasa lisinas un-, mono-o di-metilados. El ensayo es también aplicable a metiltransferasas lisina dando el saMe productos de reacción. Aquí, se utiliza una combinación de la química metilación reductiva y espectrometría de masa MALDI para medir la actividad de LSD1, un desmetilasa lisina capaz de eliminar di y mono-metil grupos, en un sustrato peptídico sintético 5. Este ensayo es simple y fácilmente susceptibles a cualquier laboratorio con el acceso a un espectrómetro de masas MALDI en el laboratorio oa través de una instalación de la proteómica. El ensayo tiene ~ 8 veces el rango dinámico y es fácilmente escalable para formato de placa 5.

Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Se presenta un método para el uso de espectrometría de masas MALDI y la química de la metilación reductiva para cuantificar los cambios en la metilación de la lisina.

Aplicación de MassSQUIRM para mediciones cuantitativas de la actividad desmetilasa Lisina

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Investigación

Biología

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

Análisis y construcción de estructuras de ácidos nucleicos con 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Análisis de la especificidad de la proteína lisina metiltransferasas Usando SPOT Péptido Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Desarrollo y caracterización de<em&gt; In Vitro</em&gt; Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Y la producción de óxido nítrico

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Aplicación de medición de electrofisiología para estudiar la actividad de transportadores de Electro-neutro

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Cuantificación de proteína específica lisina acetilación y Succinylation estequiometría usando Spectrometry total de la adquisición de datos-independiente

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...