Name: application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Vi tackar UAMS Proteomics faciliteten för masspektrometrisk stöd. Finansieringen för detta projekt har tillhandahållits av NIH bidrag P20RR015569, P20RR016460 och R01DA025755.

Detta protokoll är modifierad från Blair et al. 6. 1. LSD1 Demetylering Analys <ol><li> I en slutlig volym av 20 | il, kombinera 125 ng rekombinant LSD1 med 0,25 ^ g di-metyl histon H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) i demetylas-buffert (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5% glycerol). Dessutom utför en peptid ensam kontroll utan enzym. Kontrollen är för avsnitt 3 och behöver inte reduktiv metylering. </li><li> Inkubera under 2 timma...

<ol>
	<li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+a+landscape+takes+shape.">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+(KDM5)+Enzymes+in+Cancer.">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li><li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes.">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li><li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MassSQUIRM:+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity.">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li><li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1:+a+molecular+motor.">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li><li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling.">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li><li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression.">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li><li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs.">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li></ol>

MassSQUIRM är en billig och kvantitativ metod för heltäckande analys av aktiviteten av lysin demethylases involverade i mono-och di-metylering. MassSQUIRM erbjuder kvantifiering inte bara av produkten av reaktionen, utan även för mellanprodukterna. Denna analys kan användas som ett kraftfullt verktyg för att studera mekanismen för LSD1 och andra histon demethylases. Det kommer också att vara användbara för att klassificera många nyligen upptäckta lysin demetylas enzymer såsom PHF8 och skulle kunna använda...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biosciences </td><td> 50.100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-biotin-peptid </td><td> framställdes internt </td><td> ingen </td></tr><tr><td> POROS R2 20 micron pärlor </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Trifluorättiksyra (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28.904 </td></tr><tr><td> acetonitril </td><td> Fisher </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-dihydroxibensoesyra </td><td> Sigma </td><td> 85.707 </td></tr><tr><td> Borandimetylamin </td><td> Sigma </td><td> 180.238 </td></tr><tr><td> isotopiskt tung d 2-formaldehyd </td><td> Cambridge Isotope Laboratories </td&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Fisher </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl2- </td><td> Fisher </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fisher </td><td> G33 </td></tr><tr><td> Myrsyra </td><td> Fluka </td><td> 06.440 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Na-fosfat </td><td> Fisher </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac Concentrator </td><td> Savant </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF masspektrometer och TOFworks mjukvara </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> ingen </td></tr></tbody></table>

application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity

Nyligen har epigenetiska regulatorer upptäckts som viktiga aktörer i många olika sjukdomar 1-3. Som ett resultat av dessa enzymer är viktiga mål för små molekyler studier och utveckling av läkemedel 4. Många epigenetiska regulatorer har endast nyligen upptäckts och är fortfarande i färd med klassificeras. Bland dessa enzymer är lysin demethylases som avlägsnar metylgrupper från lysiner på histoner och andra proteiner. På grund av den nya typen av denna klass av enzymer, har få analyser har utvecklats för att studera deras aktivitet. Detta har varit en vägspärr till både klassificering och hög kapacitet studie av histon demethylases. För närvarande mycket få demetylas analyser finns. De som finns tenderar att vara av kvalitativ art och kan inte samtidigt urskilja mellan de olika lysin metylering stater (FN, mono-, di-och tri-). Masspektrometri används ofta för att bestämma demetylas aktivitet men nuvarande masspektrometriska analyser görinte upp om differentiell metylerade peptider jonisera annorlunda. Differential jonisering av metylerade peptider som gör en jämförelse metylering stater svårt och definitivt inte kvantitativt (Figur 1A). Således finns analyserna inte är optimerade för den omfattande analysen av demetylas aktivitet. Här beskriver vi en metod som kallas MassSQUIRM (masspektrometrisk kvantifiering med användning av isotopiskt reduktiv metylering) som är baserad på reduktiv metylering av amingrupper med deutererad formaldehyd för att tvinga alla lysiner vara di-metylerad, vilket sålunda gör dem väsentligen samma kemiska arter och därför jonisera samma (figur 1B). Den enda kemiska skillnaden efter reduktiv metylering är väte och deuterium, som inte påverkar MALDI jonisering effektivitet. Den MassSQUIRM Analysen är specifik för demetylas reaktionsprodukter med FN-, mono-eller di-metylerade lysiner. Analysen är också tillämplig på lysin metyltransferaser som ger SAmig reaktionsprodukter. Här använder vi en kombination av reduktiv metylering kemi och MALDI masspektrometri för att mäta aktiviteten av LSD1, en ​​lysin demetylas förmåga att avlägsna di-och mono-metylgrupper, på ett syntetiskt peptidsubstrat 5. Denna analys är enkel och lätt tillgängliga för varje laboratorium med tillgång till ett MALDI masspektrometer i laboratoriet eller genom en proteomik anläggning. Analysen har ~ 8-faldig dynamiskt omfång och är lätt skalbar för att plattformat 5.

Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Vi presenterar en metod för användning av MALDI masspektrometri och reduktiv metylering kemi för att kvantifiera förändringar i lysin-metylering.

Tillämpning av MassSQUIRM om kvantitativa mätningar av Lysin demetylas aktivitet

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Test för att mäta aktiviteten hos Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Kvantitativ Real-time Analysis of Base excision reparation aktivitet i cellysat Produkten bygger på sårspecifik Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

Analysera och bygga nukleinsyrastrukturer med 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosoliska Kalcium Mätningar i Renal epitelceller med flödescytometri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Specificitet Analys av protein lysin metyltransferaser Använda SPOT Peptide matriser

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionell beredning och Kanalaktivitets Mätningar av renat Vildtyps och Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Utveckling och karakterisering av<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrokärls Nätverk och kvantitativa mätningar av Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Och produktionen av kväveoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Tillämpningen av elektrofysiologi mätning av att studera aktiviteten av Electro-Neutral transportörer

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifiering av platsspecifika Protein lysin acetylering och Succinylation stökiometri använder Data-oberoende förvärv masspektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...