Name: reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis
Uploaded: 2012-02-22T12:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal NIH K08NS065157 (al TAF) Inoltre, il Centro Penn per disordini muscoloscheletrici, Numero P30AR050950 Award dal National Institute of Arthritis, malattie del sistema muscoloscheletrico e Pelle sostenuto questo lavoro (TAF e Steven S. Scherer). Infine, Shriners Pediatric Research finanziamento Seed Center (TAF) ha sostenuto questo lavoro. Vorremmo ringraziare il dottor Young-Jin Son inizialmente per dimostrare tutta la procedura di montaggio e di Amy A. Kim per la sua assistenza nella produzione i disegni della figura 1.

1. Soggetti animali 1,1. Trattamento <ol><li> Tutte le procedure sugli animali deve essere effettuata con l&#39;approvazione della Animal Care dell&#39;istituzione locale e del comitato etico e in conformità con l&#39;uso e il Comitato e le linee guida dei National Institutes of Health, con le misure adottate per ridurre al minimo il dolore e disagio. </li><li> I nostri topi sono stati alloggiati in condizioni di temperatura controllata di 12 ore di luce di retromarcia e del ciclo di scuro, ...

<ol>
	<li>Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neurotoxic+and+neuroprotective+agents+on+peripheral+nerve+regeneration+assayed+by+time-lapse+imaging+in+vivo.">Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).</li><li>Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+A+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).</li><li>Amado, S., Sim&#241;es, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Lu&#237;s, A. L., Shirosaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hybrid+chitosan+membranes+and+N1E-115+cells+for+promoting+nerve+regeneration+in+an+axonotmesis+rat+model.">Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model.</a> Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).</li><li>Lu&#237;s, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Sim&#240;es, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+transplantation+effects+on+sciatic+nerve+regeneration+after+a+standardized+crush+injury+in+the+rat.">Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat.</a> Microsurgery. 28, 458-470 (2008).</li><li>Lu&#237;s, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Sim&#240;es, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+morphological+assessment+of+a+standardized+rat+sciatic+nerve+crush+injury+with+a+non-serrated+clamp.">Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp.</a> J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).</li><li>Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+assess+function+after+sciatic+nerve+lesion+in+the+mouse+-+adaptation+of+the+sciatic+static+index.">A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse - adaptation of the sciatic static index.</a> J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).</li><li>Ronchi, G., Raimondo, S., Varej&#227;o, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+crush+injury+of+the+mouse+median+nerve.">Standardized crush injury of the mouse median nerve.</a> J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).</li><li>Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin+G-2+ligand+mRNA+is+downregulated+in+spinal+motoneurons+after+sciatic+nerve+lesion.">Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion.</a> Neuroreport. 21, 782-785 (2010).</li><li>Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+potential+role+of+SOCS1+and+SOCS3+in+Wallerian+degeneration+in+injured+peripheral+nerve.">Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve.</a> Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).</li><li>Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+axonal+regeneration+in+the+central+and+peripheral+nervous+systems+of+the+NG2-deficient+mouse.">Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse.</a> BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).</li><li>Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+N-CAM+and+N-cadherin+expression+in+axotomized+and+crushed+rat+sciatic+nerve.">Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve.</a> J. Anat. 206, 69-78 (2005).</li><li>Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+nerve+crushes+with+a+non-serrated+clamp.">Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp.</a> J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).</li></ol>

Abbiamo presentato un metodo per ottenere uno schiacciamento del nervo sciatico affidabile completo con marcatura precisa del sito cotta. Come accennato in precedenza, crush del nervo sciatico è un modello comune di lesione dei nervi periferici nei topi e nei ratti. Sebbene ogni metodo di compressione ha i suoi vantaggi e svantaggi, abbiamo trovato questo metodo ha prodotto una cotta completo che era facilmente contrassegnata con un minimo di attrezzature speciali (ad esempio pinze speciali, ecc.) <p class="jove_st...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione / quantità) </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Clipper Mini 0000 il n Lama </td><td> Roboz </td><td> RC-5903 </td></tr><tr><td> Nair Remover Capelli (9 oz.) </td><td> Chiesa e Dwight Co., Inc. </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Betadine Scrub chirurgico (1 gallone) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19066452 </td></tr><tr><td> Unguento oftalmico (1 oz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19082795 </td></tr></tbody></table> Strumenti chirurgici: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione / quantità) </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> FST 250 Hot tallone sterilizzatore </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 18000-45 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Scissors Iris (11 cm di lunghezza) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 500216 </td></tr><tr><td> Potts-Smith Pinza (Straight, 18 centimetri; 1x2 Teeth) </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11024-18 </td></tr><tr><td> McPherson-Vännäs Scissors (5 lame mm) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 14124-G </td></tr><tr><td> Dumont # 5 - Pinza Dumoxel standard Tip </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11252-30 </td></tr><tr><td> Dumont # 5/45 - Pinza Dumoxel standard Tip </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11251-35 </td></tr><tr><td> Ultra hemostats Arti (Diritto; superfici interne lisce) </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 13020-12 </td></tr><tr><td> Carbone attivo in polvere (500 g) </td><td> Fisher Scientific </td><td> C272-500 </td></tr><tr><td> Dimensione 6-0 suture con C-1 ago (sterile, Seta, Nero, intrecciato,Non assorbibile, 18 &quot;Length, Box di 36) </td><td> Roboz </td><td> SUT-1073-1011 </td></tr><tr><td> Reflex Applier Clip (per 9 clip mm) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 500345 </td></tr><tr><td> 9 mm in acciaio inossidabile Clips Reflex (100/box) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 500346 </td></tr></tbody></table> Animal Care: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione / quantità) </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 0,9% cloruro di sodio per iniezione (conservanti, 20 mL) </td><td> Hospira </td><td> 0409-4888-20 </td></tr><tr><td> Sistema completo Blanket omeotermi con sonda flessibile (Medium, 115 VAC, 60 Hz) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 507222F </td></tr></tbody></table> Platfor chirurgicom retrattori di: (Acquistato nel negozio di ferramenta locale) <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione /) </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Piattaforma in acciaio inossidabile (Lavorato; x1 ~ 12 &quot;x12&quot; / 8 &quot;) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Magneti Button (Esempio: Eclipse e825) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Viti in acciaio inox (3 &quot;Long; Diametro Determinato da Magneti Button) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Dadi in acciaio inox (di dimensioni adatte a Bulloni) </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Elastici (Tension Light) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Pins insetti (entrambe le estremità piegate a formare ganci) </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Semi-Fluidifica: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione / quantità) </td><td> Fornitore &lt;/ Strong&gt; </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Paraformaldeide (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1KG </td></tr><tr><td> Sodio fosfato bibasico anidro (500 g; utilizzato per preparare tampone fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Sodio fosfato monobasico anidro (1 kg, utilizzati per preparare tampone fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> Glutaraldeide (50%, 10 x 10 mL) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18431 </td></tr><tr><td> Osmio di diazoto (4% acquosa, 10 x 10 mL) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18465 </td></tr><tr><td> Ossido di propilene (450 mL) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18601 </td></tr><tr><td> Incorpora 812 (Kit, per i blocchi duri / contrasto immagine ad alta) </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 14120 </td></tr><tr><td> Toluidine blu (25 g) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 19451 </td></tr></tbody></table> Tutta Monte Preparazione muscolare e Immunoistochimica: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione / quantità) </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Paraformaldeide (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1KG </td></tr><tr><td> Sodio fosfato bibasico anidro (500 g; utilizzato per preparare tampone fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Sodio fosfato monobasico anidro (1 kg, utilizzati per preparare tampone fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> 10% di BSA diluente / Blocking Solution (200 mL) </td><td> Kirkegaard &amp; Perry Laboratories, Inc. </td><td> 50-61-00 </td></tr><tr><td> Triton X-100 (100 mL) </td&gt; <td> Dot scientifico Incorporated </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Glicina, 98% (1 kg) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC12007-0010 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (causa del 12, 4 bottiglie oz) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-373-65 </td></tr><tr><td> Sylgard DOW 170 (2 Kit lb) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9492579 </td></tr><tr><td> Insetti in acciaio inox Pins, Size 1, 100/PKG) </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 26001-40 </td></tr><tr><td> Tetrametilrodamina-A-bungarotossina (0,5 mg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0195-.5MG </td></tr><tr><td> Mouse anticorpo monoclonale contro SMI-312 (0,1 ml) </td><td> Covance </td><td> SMI-312R </td></tr><tr><td> Mouse anticorpo monoclonale contro SV2 (0,1 mL) </td><td> Developmental Studies ibridomi Bank (DSHB) </td><td> SV2 </td></tr><tr><td> Coniglio PolyAnticorpo clonale Contro GAP-43 </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB300-143 </td></tr><tr><td> Flourescein capra coniugato anti-topo IgG, Fcy Subclass uno specifico </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=115-095-205&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">11 5-095-205</a> </td></tr><tr><td> DyLight 649 coniugata Donkey Anti-Rabbit IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=711-495-152&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">711-495-152</a> </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI, dilactate; 10 mg) </td><td> Invitrogen </td><td> D3571 </td&gt; </tr><tr><td> Vectashield Mezzo di montaggio (10 mL) </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1000 </td></tr><tr><td> SuperFrost Plus preparati microscopici (Bianco; Dimensioni: 75 x 25 mm, confezione da 144) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Fisherfinest Premium Occhiali copertina (dimensioni: 40 x 22 mm, confezione da 1 oz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5C </td></tr></tbody></table>

reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis

Rigenerazione del sistema nervoso periferico (SNP) è ampiamente studiata sia per la sua rilevanza per le malattie umane e comprendere la robusta risposta rigenerativa montato dai neuroni PNS così eventualmente illuminano i fallimenti di rigenerazione CNS 1. Schiacciamento del nervo sciatico (assonotmesi) è uno dei modelli più comuni di lesioni dei nervi periferici nei roditori 2. Frantumazione interrompe tutti gli assoni delle cellule di Schwann, ma lamine basali sono conservati in modo che la rigenerazione è ottimale 3,4. Ciò consente al ricercatore di studiare proprio la capacità di un assone di interagire sia con il cellule di Schwann e lamine basale 4. I ratti sono stati generalmente i modelli animali preferiti per schiacciamento del nervo sperimentale. Essi sono ampiamente disponibili e la loro nervo sciatico lesionato fornisce una ragionevole approssimazione delle lesioni nervose umane 5,4. Anche se di dimensioni inferiori rispetto ratto del nervo, il nervo mouse è dotato di molte qualità simili. Ma, soprattutto, mousmodelli E sono sempre più prezioso per l&#39;ampia disponibilità di linee transgeniche permette ora una dissezione dettagliata delle singole molecole fondamentali per la rigenerazione del nervo 6, 7. Precedenti ricercatori hanno usato diversi metodi per produrre uno schiacciamento del nervo o lesioni anche semplici pinzette angolate, pinze fredde, pinze emostatiche, pinze vascolari, e morsetti investigatore progettati 8,9,10,11,12. Gli investigatori hanno anche utilizzato vari metodi di marcatura del sito procurando lesioni sutura, particelle di carbonio e perline fluorescenti 13,14,1. Descriviamo il nostro metodo per ottenere uno schiacciamento del nervo sciatico riproducibile completa con un accurato e persistente marcatura del crush-sito utilizzando una pinza emostatica e sottili di carbonio conseguente schiacciamento-site marcatura. Come parte della nostra descrizione della procedura crush del nervo sciatico abbiamo anche incluso un metodo relativamente semplice di montare tutto muscoli che usiamo per quantificare successivamente rigenerazione.

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Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

In questo rapporto si descrive un metodo per schiacciare nervo sciatico mouse. Questo metodo utilizza pinze emostatiche immediatamente disponibili e facilmente riproducibile e produce completo schiacciamento del nervo sciatico. Inoltre, si descrive un metodo per preparare supporti muscolo intero adatti per l&#39;analisi di rigenerazione nervosa dopo schiacciamento del nervo sciatico.

Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

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Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse

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