Name: reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis
Uploaded: 2012-02-22T12:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede K08NS065157 (a TAF) Além disso, o Centro Penn para lesões músculo-esqueléticas, P30AR050950 Prêmio Número do Instituto Nacional de Artrite, Doenças músculo-esqueléticas e da pele apoiaram este trabalho (TAF e Steven S. Scherer). Finalmente, Shriners Pediatric Research financiamento semente Center (TAF) apoiaram este trabalho. Nós gostaríamos de agradecer o Dr. Young-Jin Son inicialmente para demonstrar todo o processo de montagem e Amy A. Kim por sua ajuda na produção dos desenhos da Figura 1.

1. Sujeitos animais 1,1. Tratamento <ol><li> Todos os procedimentos com animais deve ser realizada com a aprovação do modelo assistencial local Animal e Comitê de Ética e de acordo com o uso ea Comissão e os Institutos Nacionais da Saúde, com as medidas tomadas para minimizar a dor e desconforto. </li><li> Os nossos ratinhos foram alojados sob condições controladas de temperatura sobre uma luz reversa de 12 horas e ciclo escuro, enquanto alimentados rato Chow e água ad libitum. </li>...

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	<li>Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neurotoxic+and+neuroprotective+agents+on+peripheral+nerve+regeneration+assayed+by+time-lapse+imaging+in+vivo.">Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).</li><li>Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+A+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).</li><li>Amado, S., Sim&#241;es, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Lu&#237;s, A. L., Shirosaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hybrid+chitosan+membranes+and+N1E-115+cells+for+promoting+nerve+regeneration+in+an+axonotmesis+rat+model.">Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model.</a> Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).</li><li>Lu&#237;s, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Sim&#240;es, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+transplantation+effects+on+sciatic+nerve+regeneration+after+a+standardized+crush+injury+in+the+rat.">Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat.</a> Microsurgery. 28, 458-470 (2008).</li><li>Lu&#237;s, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Sim&#240;es, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+morphological+assessment+of+a+standardized+rat+sciatic+nerve+crush+injury+with+a+non-serrated+clamp.">Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp.</a> J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).</li><li>Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+assess+function+after+sciatic+nerve+lesion+in+the+mouse+-+adaptation+of+the+sciatic+static+index.">A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse - adaptation of the sciatic static index.</a> J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).</li><li>Ronchi, G., Raimondo, S., Varej&#227;o, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+crush+injury+of+the+mouse+median+nerve.">Standardized crush injury of the mouse median nerve.</a> J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).</li><li>Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin+G-2+ligand+mRNA+is+downregulated+in+spinal+motoneurons+after+sciatic+nerve+lesion.">Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion.</a> Neuroreport. 21, 782-785 (2010).</li><li>Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+potential+role+of+SOCS1+and+SOCS3+in+Wallerian+degeneration+in+injured+peripheral+nerve.">Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve.</a> Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).</li><li>Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+axonal+regeneration+in+the+central+and+peripheral+nervous+systems+of+the+NG2-deficient+mouse.">Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse.</a> BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).</li><li>Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+N-CAM+and+N-cadherin+expression+in+axotomized+and+crushed+rat+sciatic+nerve.">Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve.</a> J. Anat. 206, 69-78 (2005).</li><li>Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+nerve+crushes+with+a+non-serrated+clamp.">Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp.</a> J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).</li></ol>

Nós apresentamos um método para obter um esmagamento do nervo ciático confiável completa com marcação precisa do local do esmagamento. Como mencionado anteriormente, esmagamento do nervo ciático é um modelo comum de lesão do nervo periférico em ratinhos e ratos. Apesar de cada método de esmagamento tem as suas vantagens e desvantagens, encontramos este método produziu uma queda completa que foi facilmente marcado com um mínimo de equipamento especial (por exemplo, braçadeiras especiais, etc). <p class=...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrição / quantidade) </td><td> Fornecedor </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Clipper Mini com No. 0000 Lâmina </td><td> Roboz </td><td> RC-5903 </td></tr><tr><td> Nair Depilação (9 oz.) </td><td> Igreja e Dwight Co., Inc. </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Scrub Betadine Cirúrgica (1 galão) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19066452 </td></tr><tr><td> Pomada oftálmica (1 oz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19082795 </td></tr></tbody></table> Os instrumentos cirúrgicos: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrição / quantidade) </td><td> Fornecedor </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> FST 250 Hot talão esterilizador </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 18000-45 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Iris Tesoura (11 cm de comprimento) </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 500216 </td></tr><tr><td> Potts-Smith Fórceps (Straight; 18 centímetros; 1x2 Dentes) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11024-18 </td></tr><tr><td> McPherson Vannas-Tesoura (5 lâminas mm) </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 14.124-G </td></tr><tr><td> Dumont # 5 - Fórceps Dumoxel Padrão Dica </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11252-30 </td></tr><tr><td> Dumont # 5/45 - Fórceps Dumoxel Padrão Dica </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11251-35 </td></tr><tr><td> Ultra hemostats Belas (em linha reta; superfícies internas lisas) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 13020-12 </td></tr><tr><td> Carbono activado em pó (500 g) </td><td> Fisher Scientific </td><td> C272-500 </td></tr><tr><td> Tamanho 6-0 com C-1 Agulha (Silk, estéril, Preto, Trançado,Não-absorvível; 18 &quot;Comprimento; Box of 36) </td><td> Roboz </td><td> SUT-1073-1011 </td></tr><tr><td> Reflex Aplicador Clip (para 9 clipes mm) </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 500345 </td></tr><tr><td> 9mm aço inoxidável Clipes de Reflexos (100/box) </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 500346 </td></tr></tbody></table> Animal Care: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrição / quantidade) </td><td> Fornecedor </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> 0,9% de cloreto de sódio (Conservante livre; 20 mL) </td><td> Hospira </td><td> 0409-4888-20 </td></tr><tr><td> Sistema completo Blanket homeotérmicos com sonda flexível (Medium, 115 VAC, 60 Hz) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 507222F </td></tr></tbody></table> Platfor cirúrgicom e Afastadores: (Comprado em loja de ferragens local) <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrição /) </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Inoxidável plataforma de aço (moído; ~ 12 &quot;x12&quot; x1 / 8 &quot;) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ímãs Button (Exemplo: Eclipse E825) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Parafusos de aço inoxidável (3 &quot;Long; diâmetro determinado pelo imã Button) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Porcas de aço inoxidável (sob medida para caber Bolts) </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Bandas de borracha (tensão leve) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Pinos de insetos (ambos os extremos dobrados para formar Ganchos) </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Semi-Thins: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrição / quantidade) </td><td> Fornecedor &lt;/ Strong&gt; </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Paraformaldeído (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1KG </td></tr><tr><td> Fosfato de Sódio Dibásico anidro (500 g; utilizado para preparar tampão fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio monobásico anidro (1 kg; usado para preparar tampão fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> O glutaraldeído (50%; 10 x 10 mL) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18431 </td></tr><tr><td> Tetróxido de ósmio (aquoso a 4%, 10 x 10 mL) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18465 </td></tr><tr><td> Óxido de propileno (450 mL) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18601 </td></tr><tr><td> Incorporar 812 (Kit, para os blocos rígidos / alto contraste de imagem) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 14120 </td></tr><tr><td> Toluidine azul (25 g) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 19451 </td></tr></tbody></table> Preparação muscular de todo o monte e Imuno-histoquímica: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrição / quantidade) </td><td> Fornecedor </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Paraformaldeído (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1KG </td></tr><tr><td> Fosfato de Sódio Dibásico anidro (500 g; utilizado para preparar tampão fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio monobásico anidro (1 kg; usado para preparar tampão fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> 10% de BSA Diluente Solução / bloqueio (200 mL) </td><td> Kirkegaard e Perry Laboratories, Inc. </td><td> 50-61-00 </td></tr><tr><td> Triton X-100 (100 mL) </td&gt; <td> Dot Scientific Incorporated </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Glicina, 98% (1 kg) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC12007-0010 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (acórdão de 12, 4 garrafas de oz) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-373-65 </td></tr><tr><td> Sylgard DOW 170 (2 Kit lb) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9492579 </td></tr><tr><td> Pinos de aço inoxidável de insetos, Tamanho 1 (100/pkg) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 26001-40 </td></tr><tr><td> Tetrametilrodamina-A-bungarotoxina (0,5 mg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0195-.5MG </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal de ratinho contra a SMI-312 (0,1 mL) </td><td> Covance </td><td> SMI-312R </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal de ratinho contra o SV2 (0,1 mL) </td><td> Desenvolvimento de Estudos Hybridoma Bank (DSHB) </td><td> SV2 </td></tr><tr><td> Coelho PolyAnticorpo contra clonal GAP-43 </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB300-143 </td></tr><tr><td> Flourescein de cabra conjugado IgG anti-ratinho, Fcy subclasse 1 específico </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=115-095-205&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">11 5-095-205</a> </td></tr><tr><td> DyLight 649 Conjugado de burro anti-IgG de coelho </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=711-495-152&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">711-495-152</a> </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, dilactate; 10 mg) </td><td> Invitrogen </td><td> D3571 </td&gt; </tr><tr><td> Meio de Montagem Vectashield (10 mL) </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1000 </td></tr><tr><td> Além disso Superfrost Lâminas de Microscopia (branco, Tamanho: 75 x 25 mm; Pack of 144) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Óculos Fisherfinest Premium Cover (Tamanho: 40 x 22 mm; Pack de 1 oz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5C </td></tr></tbody></table>

reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis

Regeneração do sistema nervoso periférico (SNP) é amplamente estudada tanto pela sua importância para as doenças humanas e para entender a resposta robusta regenerativo montado pelos neurônios do SNP, assim, possivelmente, iluminando as falhas do CNS regeneração 1. Esmagamento do nervo ciático (axoniotmese) é um dos modelos mais comuns de lesão do nervo periférico em roedores 2. Esmagamento interrompe todos os axônios, mas Schwann lâminas de células basais são preservados para que a regeneração é ideal 3,4. Isto permite que o investigador para estudar precisamente a capacidade de um axónio crescente para interagir com tanto a célula de Schwann e as lâminas basais 4. Ratos foram geralmente os modelos animais preferidos para esmagamento do nervo experimental. Eles são amplamente disponíveis e seu nervo lesado fornece uma aproximação razoável das lesões nervosas humanas 5,4. Embora menor em tamanho do que rato nervo, o nervo do mouse tem muitas qualidades semelhantes. Mais importante, porém, mousmodelos E são cada vez mais valiosa porque a grande disponibilidade de linhas transgénicas permite agora uma dissecção detalhada das moléculas individuais críticos para a regeneração do nervo 6, 7. Antes investigadores usaram vários métodos para produzir uma queda ou lesão do nervo, incluindo simples fórceps, pinças anguladas refrigerados, pinças hemostáticas, braçadeiras e fixações, vasculares, investigador-concebidas 8,9,10,11,12. Os pesquisadores também utilizaram vários métodos para marcar o local da lesão, incluindo sutura, partículas de carbono e partículas fluorescentes 13,14,1. Nós descrevemos o nosso método para obter um esmagamento do nervo ciático reprodutivelmente completa com precisão e persistente marcação do local de esmagamento utilizando uma pinça fina hemostáticos e carbono subsequente esmagamento do local de marcação. Como parte de nossa descrição do procedimento de esmagamento do nervo ciático incluímos também um método relativamente simples de montar todo músculo que usamos para quantificar a regeneração posteriormente.

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Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Neste relatório nós descrevemos um método para esmagamento do nervo ciático do rato. Este método usa prontamente disponíveis pinça hemostática e facilmente reproduzível e produz esmagamento do nervo ciático completa. Além disso, nós descrevemos um método para preparar montagens de músculos inteiros adequados para análise da regeneração do nervo após esmagamento do nervo ciático.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Neurociência

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Preparação Monte todo o Adulto Drosophila Cordão nervoso ventral para injeção gigante de fibra Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Colorindo, Visualização e Análise de Papilas de Fungos, Circunvalolados e Paladar

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...