Name: reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis
Uploaded: 2012-02-22T12:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones K08NS065157 (al TAF) Además, el Centro Penn para los trastornos musculoesqueléticos, P30AR050950 Premio Número del Instituto Nacional de Artritis, Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel apoya este trabajo (TAF y Steven S. Scherer). Por último, Shriners Pediatric Research Center financiación inicial (TAF) apoya este trabajo. Nos gustaría agradecer al Dr. Young-Jin Hijo de un principio que demuestra todo el procedimiento de montaje y Amy A. Kim, por su asistencia en la elaboración de los bocetos de la figura 1.

1. Los sujetos animales 1,1. Tratamiento <ol><li> Todos los procedimientos con animales se debe realizar con la aprobación del Cuidado de Animales de la institución local y el Comité de Ética y de acuerdo con el uso y el Comité y de los Institutos Nacionales de Salud directrices, con las medidas adoptadas para minimizar el dolor y el malestar. </li><li> Nuestros animales fueron alojados en condiciones controladas de temperatura en una luz de marcha atrás de 12 horas y el ciclo oscuro, m...

<ol>
	<li>Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neurotoxic+and+neuroprotective+agents+on+peripheral+nerve+regeneration+assayed+by+time-lapse+imaging+in+vivo.">Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).</li><li>Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+A+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).</li><li>Amado, S., Sim&#241;es, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Lu&#237;s, A. L., Shirosaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hybrid+chitosan+membranes+and+N1E-115+cells+for+promoting+nerve+regeneration+in+an+axonotmesis+rat+model.">Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model.</a> Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).</li><li>Lu&#237;s, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Sim&#240;es, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+transplantation+effects+on+sciatic+nerve+regeneration+after+a+standardized+crush+injury+in+the+rat.">Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat.</a> Microsurgery. 28, 458-470 (2008).</li><li>Lu&#237;s, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Sim&#240;es, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+morphological+assessment+of+a+standardized+rat+sciatic+nerve+crush+injury+with+a+non-serrated+clamp.">Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp.</a> J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).</li><li>Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+assess+function+after+sciatic+nerve+lesion+in+the+mouse+-+adaptation+of+the+sciatic+static+index.">A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse - adaptation of the sciatic static index.</a> J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).</li><li>Ronchi, G., Raimondo, S., Varej&#227;o, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+crush+injury+of+the+mouse+median+nerve.">Standardized crush injury of the mouse median nerve.</a> J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).</li><li>Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin+G-2+ligand+mRNA+is+downregulated+in+spinal+motoneurons+after+sciatic+nerve+lesion.">Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion.</a> Neuroreport. 21, 782-785 (2010).</li><li>Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+potential+role+of+SOCS1+and+SOCS3+in+Wallerian+degeneration+in+injured+peripheral+nerve.">Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve.</a> Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).</li><li>Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+axonal+regeneration+in+the+central+and+peripheral+nervous+systems+of+the+NG2-deficient+mouse.">Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse.</a> BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).</li><li>Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+N-CAM+and+N-cadherin+expression+in+axotomized+and+crushed+rat+sciatic+nerve.">Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve.</a> J. Anat. 206, 69-78 (2005).</li><li>Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+nerve+crushes+with+a+non-serrated+clamp.">Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp.</a> J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).</li></ol>

Hemos presentado un método para obtener un flechazo nervio ciático fiable completa con identificación exacta del sitio de aplastamiento. Como se mencionó anteriormente, aplastamiento del nervio ciático es un modelo común de lesión del nervio periférico en ratones y ratas. Aunque cada método de aplastamiento tiene sus ventajas y desventajas, nos pareció que este método produce un flechazo total que se marcó con facilidad con un mínimo de equipos especiales (por ejemplo, unas pinzas especiales, etc.) <p c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción / cantidad) </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Clipper Mini 0000 con el N º hoja </td><td> Roboz </td><td> RC-5903 </td></tr><tr><td> Nair depilación (9 oz.) </td><td> Iglesia y Dwight Co., Inc. </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Betadine lavado quirúrgico (1 galón) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19066452 </td></tr><tr><td> Ungüento oftálmico (1 oz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19082795 </td></tr></tbody></table> Herramientas quirúrgicas: <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción / cantidad) </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> FST 250 Hot cordón esterilizador </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 18000-45 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Iris Tijeras (11 cm de largo) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 500216 </td></tr><tr><td> Potts-Smith Pinzas (recta, 18 cm; 1x2 dientes) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11024-18 </td></tr><tr><td> McPherson Vannas Tijeras (5 cuchillas mm) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 14124-G </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinzas-Dumoxel Standard Tip </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11252-30 </td></tr><tr><td> Dumont º 5/45 Pinzas-Dumoxel Standard Tip </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11251-35 </td></tr><tr><td> Ultra Hemostats Bellas (recto; superficies lisas en su interior) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 13020-12 </td></tr><tr><td> Carbón activado en polvo (500 g) </td><td> Fisher Scientific </td><td> C272-500 </td></tr><tr><td> Tamaño 6-0 Suturas con aguja C-1 (Silk estéril, Negro, trenzado,No absorbible, 18 &quot;de longitud, caja de 36) </td><td> Roboz </td><td> SUT-1073-1011 </td></tr><tr><td> Reflejo de aplicador de clips (de 9 mm clips) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 500345 </td></tr><tr><td> 9 mm de acero inoxidable Reflex Clips (caja de 100) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 500346 </td></tr></tbody></table> Cuidado de Animales: <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción / cantidad) </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> De sodio al 0,9% de cloruro de inyección (sin conservantes; 20 ml) </td><td> Hospira </td><td> 0409-4888-20 </td></tr><tr><td> Sistema completo Manta homeotérmicos con sonda flexible (mediana, 115 VAC, 60 Hz) </td><td> Aparato de Harvard </td><td> 507222F </td></tr></tbody></table> Platfor quirúrgicam, y retractores: (Comprada en la tienda local de hardware) <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción /) </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Plataforma de acero inoxidable (molido; ~ 12 &quot;x12&quot; x1 / 8 &quot;) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Botón de imanes (Ejemplo: Eclipse E825) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Pernos de acero inoxidable (3 &quot;de largo, diámetro determinado por el imán de botón) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Tuercas de acero inoxidable (tamaño para adaptarse a los pernos) </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Las bandas de goma (tensión de Luz) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Pasadores de insectos (ambos extremos doblados para formar ganchos) </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Semi-Thins: <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción / cantidad) </td><td> Proveedor &lt;/ Strong&gt; </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> El paraformaldehído (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1kg </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio dibásico anhidro (500 g, que se utiliza para preparar tampón fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio monobásico anhidro (1 kg, que se utiliza para preparar tampón fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> Glutaraldehído (50%; 10 x 10 ml) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18431 </td></tr><tr><td> Tetróxido de osmio (4% acuoso, 10 x 10 ml) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18465 </td></tr><tr><td> Óxido de propileno (450 ml) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18601 </td></tr><tr><td> Insertar 812 (Kit, para los bloques de disco duro o alto contraste de imagen) </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 14120 </td></tr><tr><td> Toluidine Azul (25 g) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 19451 </td></tr></tbody></table> Todo el montaje en la preparación muscular y de inmunohistoquímica: <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción / cantidad) </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> El paraformaldehído (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1kg </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio dibásico anhidro (500 g, que se utiliza para preparar tampón fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio monobásico anhidro (1 kg, que se utiliza para preparar tampón fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> 10% de diluyente de BSA / solución de bloqueo (200 ml) </td><td> Kirkegaard &amp; Perry Laboratories, Inc. </td><td> 50-61-00 </td></tr><tr><td> Triton X-100 (100 ml) </td&gt; <td> Punto Científico Incorporated </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> La glicina, 98% (1 kg) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC12007-0010 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryo-octubre Compuesto (Caja de 12, 4 botellas de oz) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-373-65 </td></tr><tr><td> Sylgard DOW 170 (2 Kit de libras) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9492579 </td></tr><tr><td> Pasadores de acero inoxidable de insectos, tamaño 1 (100/caja) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 26001-40 </td></tr><tr><td> Tetrametilrodamina-A-bungarotoxina (0,5 mg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0195-.5MG </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal de ratón contra el SMI-312 (0,1 ml) </td><td> Covance </td><td> SMI-312R </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal de ratón contra SV2 (0,1 ml) </td><td> Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma (DSHB) </td><td> SV2 </td></tr><tr><td> Conejo Polyanticuerpo monoclonal contra el GAP-43 </td><td> Novus Productos Biológicos </td><td> NB300-143 </td></tr><tr><td> Fluoresceína conjugado de cabra anti-IgG de ratón, Fc gamma Subclase una específica </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=115-095-205&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">11 5-095-205</a> </td></tr><tr><td> DyLight 649 burro conjugado anti-IgG de conejo </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=711-495-152&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">711-495-152</a> </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol (DAPI, dilactato; 10 mg) </td><td> Invitrogen </td><td> D3571 </td&gt; </tr><tr><td> Medio de montaje Vectashield (10 ml) </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1000 </td></tr><tr><td> Superfrost Plus preparaciones para microscopio (Blanco, Tamaño: 75 x 25 mm, paquete de 144) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Fisherfinest gafas Premium Cover (Tamaño: 40 x 22 mm; Paquete de 1 oz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5C </td></tr></tbody></table>

reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis

La regeneración en el sistema nervioso periférico (SNP) está ampliamente estudiada tanto por su relevancia para las enfermedades humanas y entender la respuesta contundente de regeneración montada por las neuronas del SNP por lo tanto, posiblemente, iluminando los fracasos de la regeneración del SNC 1. Aplastamiento del nervio ciático (axonotmesis) es uno de los modelos más comunes de lesión del nervio periférico en roedores 2. Triturado interrumpe todos los axones pero láminas de Schwann de células basales se conservan por lo que la regeneración es óptimo 3,4. Esto permite que el investigador para estudiar precisamente la capacidad de un axón en crecimiento para interactuar tanto con la célula de Schwann y láminas basales 4. Las ratas han sido por lo general los modelos animales preferidos para el aplastamiento del nervio experimental. Están ampliamente disponibles y su nervio ciático lesionado proporciona una aproximación razonable de las lesiones nerviosas humanas 5,4. Aunque de menor tamaño que los nervios de rata, el nervio del ratón tiene muchas cualidades similares. Pero lo más importante, los Memorandos de Entendimientomodelos e son cada vez más valiosa, debido a la amplia disponibilidad de líneas transgénicas ahora permite una disección detallada de las moléculas individuales fundamentales para la regeneración del nervio 6, 7. Antes los investigadores han utilizado varios métodos para producir un aplastamiento del nervio o lesión incluyendo simples pinzas de ángulo, pinzas frías, pinzas hemostáticas, pinzas vasculares, y las abrazaderas diseñadas por el investigador 8,9,10,11,12. Los investigadores también han utilizado diversos métodos para marcar el sitio de la lesión incluyendo la sutura, las partículas de carbono y perlas fluorescentes 13,14,1. Se describe nuestro método para obtener un flechazo nervio ciático reproducible completa con información precisa y persistente marcaje de la aglomeración de sitio, con una pinza hemostática y finas de carbono posteriores al aplastamiento marcar el sitio. Como parte de nuestra descripción del procedimiento del nervio ciático aplastar también hemos incluido un método relativamente simple de montar todo el músculo que utilizamos para cuantificar posteriormente la regeneración.

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Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

En este informe se describe un método para aplastar el nervio ciático del ratón. Este método usa unas pinzas hemostáticas fácilmente disponibles y fácilmente reproducible y produce aplastamiento completo del nervio ciático. Además, se describe un método para preparar soportes de músculo entero adecuadas para el análisis de la regeneración del nervio después de aplastamiento del nervio ciático.

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Investigación

Neurociencias

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Preparación Todo el montaje del Adulto Drosophila Cordón nervioso ventral para inyección gigante tinte de fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Disección Del Músculo Transverso Abdominis Para El Análisis De La Unión Neuromuscular De Montaje Completo

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Todo el montaje de imágenes de embriones de ratón Proyecciones sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Tinción, visualización y análisis de papilas gustativas fungiformes, circunvaladas y del paladar

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...