Name: alginate microcapsule as a 3d platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hesc) to different lineages
Uploaded: 2012-03-09T12:00:00
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Este trabalho é apoiado pelo Programa Bolsa NHMRC # 568969 (PSS) e Faculdade de Medicina da Universidade de New South Wales, Stem Iniciativa Cell (KSS).

Todos os procedimentos abaixo são realizados usando técnicas assépticas dentro de um gabinete de Classe II Biossegurança. Reagentes e equipamentos utilizados estão listados nas tabelas abaixo. 1. Preparação de alginato de 1,1% (w / v) <ol><li> Adicionar 0,275 g de alginato de sódio purificado (alto teor de ácido glucurónico ≥ 60%, a viscosidade&gt; 200 mPa s, e endotoxina ≤ 100 UE / g) em um tubo ml estéril 50 e adicionar 25 ml de solução 0,1% estéril gelatina preparado a...

<ol>
	<li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm.">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li><li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation.">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li><li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance.">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li><li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+for+stem+cell+differentiation.">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li><li>Orive, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulation:+promise+and+progress.">Cell encapsulation: promise and progress.</a> Nat. Med. 9, 104-107 (2003).</li><li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled,+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture.">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li><li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells.">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li><li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus.">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li><li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li><li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li></ol>

Vários estudos com células-tronco embrionárias de rato e células estaminais embrionárias humanas têm demonstrado os benefícios do sistema de cultura 3D em biomateriais e engenharia de tecidos 2,3. Utilizou-se microcápsulas de alginato de cálcio como uma plataforma adequada 3D para estudar a propagação de hESC e diferenciação em comparação com alginato de bário desde hESC mostrou maior viabilidade significativa quando encapsulados em alginato de cálcio do que alginato de bário. Este sistema d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Alginato (Pronova UP MVG) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td> alto teor de ácido glucurónico ≥ 60%, a viscosidade&gt; 200 mPa s, e endotoxina &lt;100 UE / g </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% de NaCl </td><td> Baxter Healthcare </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> Tipo J1 talão gerador </td><td> Nisco engenharia Inc </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-Phaser bomba de seringa </td><td> Nova Era Bomba Systems Inc </td><td> Modelo NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi-Flow Fluxômetro Medical </td><td> Gascon Sistemas</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27.632 </td><td> Merck </td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro humano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G x 2 &quot;cateter IV </td><td> Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> Knockout-DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td> Para SR média (basal) </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> Para SR média (2 mM) </td></tr><tr><td> Substituição Knockout Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Para SR média (20%) </td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td> Para SR média (2,5 U / ml) </td&gt; </tr><tr><td> Insulina-Transferrina-Selênio (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 41400045 </td><td> Para SR média (1x) </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Para SR média (0,1 mM) </td></tr><tr><td> MEM Solução NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Para SR média (5 mM) </td></tr><tr><td> Glasgow meio essencial mínimo </td><td> Invitrogen </td><td> 11710035 </td><td> Para DA médio diferenciação neural (basal) </td></tr><tr><td> Substituição Knockout Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Para DA médio diferenciação neuronal (10%) </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td> Para DA médio diferenciação neuronal (1 mM) </td></tr><tr><td> MEM Solução NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Para DA nmédio diferenciação EURAL (0,1 mM) </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Para DA médio diferenciação neuronal (0,1 mM) </td></tr><tr><td> Sonic hedgehog (SHH) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> Para DA diferenciação neuronal (100 ng / ml) </td></tr><tr><td> De crescimento de fibroblastos fator 8 (FGF8a) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 4745-F8-050 </td><td> Para DA diferenciação neuronal (100 ng / ml) </td></tr></tbody></table>

alginate microcapsule as a 3d platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hesc) to different lineages

Células estaminais embrionárias (hESC) estão a emergir como uma fonte alternativa atraente para a terapia de substituição de células, uma vez que podem ser expandidas em cultura indefinidamente e diferenciados a quaisquer tipos de células no corpo. Vários tipos de biomateriais também têm sido utilizados em culturas de células estaminais para fornecer um microambiente imitando o nicho de células-tronco 1-3. O último é importante para a promoção da célula-célula interacção, a proliferação celular e diferenciação em linhagens específicas, bem como organização do tecido, proporcionando uma imagem tridimensional ambiente (3D) 4, tais como encapsulação. O princípio de encapsulamento de células envolve o aprisionamento de células vivas dentro dos limites de membranas semi-permeáveis ​​em culturas 3D 2. Estas membranas permitir a troca de nutrientes de oxigénio, e os estímulos através das membranas, enquanto que os anticorpos e células do sistema imunológico do hospedeiro que são maiores do que o tamanho dos poros da cápsula são excluídos 5. Aqui, nós préenviou uma abordagem à cultura e diferenciar neurônios hESC AD em um microambiente 3D usando microcápsulas de alginato. Temos modificado as condições de cultura 2 para aumentar a viabilidade do hESC encapsulado. Nós previamente mostrado que a adição de p160-Rho-associated espiral espiralada quinase inibidor (Rock), Y-27632 e fetal humano fibroblastos condicionado médio de substituição de soro (HFF-CM) para a plataforma de 3D aumentou significativamente a viabilidade de hESC encapsulado em que as células expressavam genes marcadores definitivos endoderme 1. Verificou-se agora utilizada esta plataforma 3D para a propagação de diferenciação hESC e eficiente para os neurónios DA. Análises de expressão de proteínas e do gene após a fase final de DA diferenciação neuronal mostrou um aumento da expressão de tirosina hidroxilase (TH), um marcador para neurónios DA, acima de 100 dobras após 2 semanas. Nós a hipótese de que a nossa plataforma 3D usando microcápsulas de alginato pode ser útil para estudar a proliferação e diferenciação dirigidade hESC para várias linhagens. Este sistema de 3D também permite a separação de células alimentadoras de hESC durante o processo de diferenciação e também tem um potencial para o isolamento-imune durante o transplante no futuro.

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Nós otimizamos uma técnica de microencapsulação como uma plataforma eficaz para a propagação 3D e diferenciação de células-tronco embrionárias a endoderme e (DA) dopaminérgicos neurônios. Ele também fornece uma oportunidade para imuno-isolamento de células do hospedeiro durante o transplante. Esta plataforma pode ser adaptado para outros tipos de células.

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

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Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

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Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

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