Name: intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood flow
Uploaded: 2012-01-14T14:00:00
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Siamo particolarmente grati a S. Graewe e V. Heussler per la formazione iniziale e continua di ingresso in microscopia intravitale di parassiti della malaria, a J. Burns per la donazione GFP parassiti transgenici, ad A. Bosch (Unità confocale, CCIT-UB, IDIBAPS) per l&#39;assistenza in analisi di immagini e quantificazione e di P. Astola per assistenza tecnica. Ringraziamo Tous R. e Caralt I. per la produzione video. MF è un destinatario di una borsa di studio laureati dal Generalità della Catalogna. HAP è un professore di ricerca ICREA. Il lavoro nel laboratorio di HAP è finanziato dal Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013) sotto della convenzione di sovvenzione n. 242095, dalla Fondazione Privata CELLEX (Catalogna, Spagna), e dal Ministero spagnolo della Scienza e dell&#39;Innovazione ( SAF2009-07760).

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in 7. 1. Infezione animale con Green Fluorescent Protein (GFP) parassiti transgenici <ol><li> P. yoelii-GFP linee transgeniche di 17XL e 17X sono stati generati utilizzando gli stessi vettori, il targeting strategia e protocolli descritti altrove per P. berghei 8. Essi esprimono il mutante 3 variante di GFP 9 anni sotto il promotore onnipresente di P. berghei allungamento f...

<ol>
	<li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+malaria+parasites--recent+advances+and+future+directions.">In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).</li><li>Heussler, V., Doerig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+enters+parasitology.">In vivo imaging enters parasitology.</a> Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).</li><li>Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+malaria+sporozoites.">Imaging malaria sporozoites.</a> in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).</li><li>Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host.">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).</li><li>Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host+hepatocytes+by+the+malaria+parasite+for+delivery+into+liver+sinusoids.">Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids.</a> Science. 313, 1287-1290 (2006).</li><li>Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+host+cell+modifications+of+Plasmodium+falciparum+blood+stages+in+four+dimensions.">Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions.</a> Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).</li><li>Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+spleen+remodelling+in+Plasmodium+yoelii+infections+in+Balb/c+mice+facilitates+adherence+and+spleen+macrophage-clearance+escape.">Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape.</a> Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).</li><li>Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle.">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein.">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein.</a> 173, 33-38 (1996).</li><li>Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li><li>Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+erythrocyte+velocity+and+retinal+blood+flow+using+adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy.">In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Bowdler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The complete spleen. , (2002).</li><li>Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+comparing+T+lymphocyte+trafficking+to+the+spleen+and+the+mesenteric+lymph+node.">Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).</li><li>Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue.">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).</li><li>Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+splenic+control+of+murine+malaria:+reticular+cell+activation+and+the+development+of+a+blood-spleen+barrier.">Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier.</a> Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).</li><li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites.">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li><li>Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+fluorescent+intravital+microscopy+of+the+murine+spleen.">Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen.</a> J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).</li><li>Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone.">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li></ol>

L&#39;attuazione di microscopia intravitale della milza in questo modello la malaria roditore ha aperto la possibilità di indagare il passaggio dinamica dei parassiti attraverso questo organo che fino ad ora è stato considerato un &quot;black-box&quot; a causa di considerazioni tecniche. Qui, un grande sforzo è stato messo per adattare un metodo quantitativo che permette l&#39;analisi comparativa delle diverse linee di parassiti a livello singolo e della popolazione. A differenza di altri tessuti e cellule, che era s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Leica TCS-SP5 microscopio confocale </td><td> Leica Microsystems, Heidelberg, Germania </td><td> TCS-SP5 non seriale. 5100000419 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina (Ketolar 50 mg / ml) </td><td> Pfizer </td><td> 631028 </td><td></td></tr><tr><td> Midazolam 15 mg / 3 ml </td><td> Normon </td><td> 838193 </td><td></td></tr><tr><td> 70.000 MW Destrano, coniugato con Texas Red </td><td> Molecular Probes </td><td> D1830 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresceina isotiocianato, isomero I (CIC) </td><td> Sigma </td><td> F7250 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> H1399 </td><td></td></tr><tr><td> Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1 </td><td> Soluzione di lavoro è al 10% in acqua distillata </td></tr><tr><td> Super Glue Loctite-3 </td><td> Loctite </td><td> 9975-0880 </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood flow

L&#39;avvento della microscopia intravitale in modelli sperimentali malaria roditore ha permesso importanti progressi alla conoscenza del parassita-ospite 1,2 interazioni. Così, in imaging in vivo di parassiti della malaria durante la pre-eritrocitaria fasi hanno portato alla luce l&#39;ingresso attivo di parassiti nei linfonodi pelle 3, il completo sviluppo del parassita nella pelle 4, e la formazione di un derivato degli epatociti merosome per assicurare la migrazione e rilascio di merozoiti nel flusso sanguigno 5. Inoltre, lo sviluppo di parassiti singoli negli eritrociti è stata recentemente documentata mediante imaging 4D e ha sfidato la nostra visione attuale in materia di esportazione delle proteine ​​della malaria 6. Così, l&#39;imaging intravitale ha radicalmente cambiato la nostra visione sugli eventi chiave nello sviluppo Plasmodium. Purtroppo, gli studi del passaggio dinamico di parassiti della malaria attraverso la milza, un organo importante linfoide squisitamente adattate per cancellare infetti rosso blood cellule sono carenti a causa di vincoli tecnici. Utilizzando il modello murino della malaria da Plasmodium yoelii in topi BALB / c, abbiamo implementato l&#39;imaging intravitale della milza e ha riportato un rimodellamento differenziale di essa e l&#39;aderenza dei globuli rossi parassitati (pRBCs) alle cellule barriera di origine fibroblastica nella polpa rosso durante infezione con il non-letale parassita linea P.yoelii 17X rispetto alle infezioni con la linea 17XL P.yoelii letale parassita 7. Per arrivare a queste conclusioni, una metodologia specifica con ImageJ software libero è stato sviluppato per consentire la caratterizzazione del veloce movimento tridimensionale del singolo pRBCs. I risultati ottenuti con questo protocollo consentono di determinare il tempo della velocità, direzionalità e di soggiorno dei parassiti nella milza, tutti i parametri di indirizzamento aderenza in vivo. Inoltre, riportiamo la metodologia per quantificare il flusso di sangue al microscopio intravitale e l&#39;uso di DIFferent coloranti al fine di conoscere la struttura complessa del microcircolo della milza. Dichiarazione etica Tutti gli studi su animali sono stati effettuati presso le strutture animale dell&#39;Università di Barcellona, ​​in conformità alle linee guida e protocolli approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell&#39;Università di Barcellona CEEA-UB (protocollo n. DMAH: 5429). Femmina Balb / c topi di 6-8 settimane di età sono stati ottenuti da Charles River Laboratories.

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Mostriamo il metodo per l&#39;esecuzione di microscopia intravitale della milza con GFP parassiti della malaria transgenici e la quantificazione della mobilità parassita e del flusso sanguigno all&#39;interno di questo organo.

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