Name: intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood flow
Uploaded: 2012-01-14T14:00:00
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Estamos particularmente gratos ao S. Graewe e Heussler V. para a formação inicial e contínua de entrada em microscopia intravital de parasitas da malária, a J. Burns para a doação de parasitas GFP transgênicos, a A. Bosch (Unidade Confocal, CCIT-UB, IDIBAPS) de assistência em análise de imagem e quantificação e P. Astola para assistência técnica. Agradecemos a R. e I. Tous Caralt para produção de vídeo. MF é um receptor de uma bolsa de pós-graduação da Generalidade da Catalunha. HAP é um professor e pesquisador ICREA. Trabalho no laboratório de HAP é financiado pelo Programa da Comunidade Europeia Sétimo Programa-Quadro (FP7/2007-2013), sob subvenção N ° 242095, pela Fundação Privada Cellex (Catalunha, Espanha), e pelo Ministério espanhol da Ciência e Inovação ( SAF2009-07760).

Este método foi utilizado na pesquisa relatada em 7. 1. Infecção animal com proteína fluorescente verde parasitas (GFP) transgênico <ol><li> Linhas P. yoelii-GFP transgênicas de 17XL e 17x foram gerados usando os mesmos vetores, visando estratégias e protocolos descritos em outra parte para P. berghei 8. Eles expressam a variante mutante do GFP 3 9 sob o promotor onipresente de P. berghei fator de elongação 1 (Pbeef1a...

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	<li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+malaria+parasites--recent+advances+and+future+directions.">In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).</li><li>Heussler, V., Doerig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+enters+parasitology.">In vivo imaging enters parasitology.</a> Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).</li><li>Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+malaria+sporozoites.">Imaging malaria sporozoites.</a> in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).</li><li>Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host.">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 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Commun. 2, 165-165 (2011).</li><li>Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+spleen+remodelling+in+Plasmodium+yoelii+infections+in+Balb/c+mice+facilitates+adherence+and+spleen+macrophage-clearance+escape.">Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape.</a> Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).</li><li>Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle.">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein.">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein.</a> 173, 33-38 (1996).</li><li>Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Bowdler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The complete spleen. , (2002).</li><li>Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+comparing+T+lymphocyte+trafficking+to+the+spleen+and+the+mesenteric+lymph+node.">Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).</li><li>Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue.">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).</li><li>Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+splenic+control+of+murine+malaria:+reticular+cell+activation+and+the+development+of+a+blood-spleen+barrier.">Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier.</a> Am. J. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone.">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li></ol>

A implementação da microscopia intravital do baço, neste modelo de malária de roedor abriu a possibilidade de investigar a passagem dinâmica de parasitas através deste órgão, que até agora tem sido considerada uma &quot;caixa-preta&quot;, devido a considerações técnicas. Aqui, um grande esforço foi colocado para adaptar um método quantitativo que permite a análise comparativa das diferentes linhas de parasita nos níveis individual e populacional. Em contraste com outros tecidos e células que tinham sido...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Leica TCS-SP5 microscópio confocal </td><td> Leica Microsystems, Heidelberg, Alemanha </td><td> TCS-SP5 n º de série. 5100000419 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina (Ketolar 50 mg / ml) </td><td> Pfizer </td><td> 631028 </td><td></td></tr><tr><td> Midazolam 15 ml mg / 3 </td><td> Normon </td><td> 838193 </td><td></td></tr><tr><td> 70.000 MW Dextran, conjugado com Texas Red </td><td> Sondas moleculares </td><td> D1830 </td><td></td></tr><tr><td> Isotiocianato de fluoresceína, isômero I (FITC) </td><td> Sigma </td><td> F7250 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> H1399 </td><td></td></tr><tr><td> Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1 </td><td> Solução de trabalho é de 10% em água destilada </td></tr><tr><td> Super Glue-3 Loctite </td><td> Loctite </td><td> 9975-0880 </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood flow

O advento da microscopia intravital em modelos de malária experimental de roedores tem permitido grandes avanços para o conhecimento de parasita-hospedeiro 1,2 interações. Assim, em imagem in vivo de parasitas da malária durante a pré-eritrocítica estágios revelaram a entrada ativa de parasitas da pele em nós linfáticos 3, o desenvolvimento completo do parasita na pele 4, ea formação de um hepatócito merosome derivados para garantir a migração e liberação de merozoítos na corrente sanguínea 5. Além disso, o desenvolvimento de parasitos nos eritrócitos foi recentemente documentado usando imagens 4D e desafiou a nossa visão atual sobre a exportação de proteínas em malária 6. Assim, imagens intravital mudou radicalmente a nossa opinião sobre eventos-chave no desenvolvimento de Plasmodium. Infelizmente, os estudos da passagem dinâmica de parasitas da malária através do baço, um órgão linfóide importante primorosamente adaptada para limpar infectados vermelho bcélulas lood faltam devido a limitações técnicas. Utilizando o modelo murino de malária Plasmodium yoelii em camundongos Balb / c, temos implementado imagem intravital do baço e relatou uma remodelação diferencial dele e aderência de glóbulos vermelhos parasitados (pRBCs) às células de origem fibroblástica barreira na polpa vermelha durante a infecção com o parasita não-letal de linha P.yoelii 17x em oposição a infecções letais com o 17XL P.yoelii linha parasita 7. Para chegar a estas conclusões, uma metodologia específica usando o software livre ImageJ foi desenvolvido para permitir a caracterização do movimento tridimensional rápida de single-pRBCs. Resultados obtidos com este protocolo permite determinar a direcionalidade, velocidade e tempo de residência de parasitas no baço, todos os parâmetros referentes a adesão in vivo. Além disso, relatamos a metodologia de quantificação do fluxo sanguíneo através de microscopia intravital eo uso de diferendiferentes corantes para obter insights sobre a estrutura da microcirculação complexas do baço. Declaração de Ética Todos os estudos com animais foram realizados no biotério da Universidade de Barcelona, ​​em conformidade com as diretrizes e protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Barcelona-UB CEEA (Protocolo n º DMAH: 5429). Feminino camundongos Balb / c de 6-8 semanas de idade foram obtidos a partir Charles River Laboratories.

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Nós mostramos o método para a realização de microscopia intravital do baço usando parasitas da malária transgênica GFP ea quantificação da mobilidade do parasita e do fluxo sanguíneo dentro do órgão.

Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Microscopia intravital do linfonodo inguinal

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

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Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

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Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

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Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

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Análise fenotípica de roedores malária parasita assexuada e estágios do sangue sexual e estágios do mosquito

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