Name: therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles
Uploaded: 2012-01-04T13:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door Alliance het National Cancer Institute in Nanotechnologie voor Centrum voor Kanker Kanker Nanotechnologie Excellence (CCNE) subsidie ​​U54-CA151881.

<ol>
	<li>Vimalachandran, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+prevention+of+pancreatic+cancer.">Genetics and prevention of pancreatic cancer.</a> Cancer. Control. 11, 6-14 (2004).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+evaluation+of+thiol-modified+gelatin+nanoparticles+for+intracellular+DNA+delivery+in+response+to+glutathione.">Preparation and evaluation of thiol-modified gelatin nanoparticles for intracellular DNA delivery in response to glutathione.</a> Bioconjug. Chem. 16, 1423-1432 (2005).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)-modified+thiolated+gelatin+nanoparticles+for+glutathione-responsive+intracellular+DNA+delivery.">Poly(ethylene glycol)-modified thiolated gelatin nanoparticles for glutathione-responsive intracellular DNA delivery.</a> Nanomedicine. 3, 32-42 (2007).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiangiogenic+gene+therapy+with+systemically+administered+sFlt-1+plasmid+DNA+in+engineered+gelatin-based+nanovectors.">Antiangiogenic gene therapy with systemically administered sFlt-1 plasmid DNA in engineered gelatin-based nanovectors.</a> Cancer. Gene. Ther. 14, 488-498 (2007).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+pharmacokinetic+analysis+of+long-circulating+thiolated+gelatin+nanoparticles+following+systemic+administration+in+breast+cancer-bearing+mice.">Biodistribution and pharmacokinetic analysis of long-circulating thiolated gelatin nanoparticles following systemic administration in breast cancer-bearing mice.</a> J. Pharm. Sci. 96, 397-407 (2007).</li><li>Kaul, G., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeted+gene+delivery+using+poly(ethylene+glycol)-modified+gelatin+nanoparticles:+in+vitro+and+in+vivo+studies.">Tumor-targeted gene delivery using poly(ethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles: in vitro and in vivo studies.</a> Pharm. Res. 22, 951-961 (2005).</li><li>Bardeesy, N., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+biology+and+genetics.">Pancreatic cancer biology and genetics.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 897-909 (2002).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+peptide+ligand+of+epidermal+growth+factor+receptor+for+targeted+delivery+of+therapeutics.">Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics.</a> FASEB. J. 19, 1978-1985 (2005).</li><li>McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+gene+therapy:+fringe+or+cutting+edge.">Cancer gene therapy: fringe or cutting edge.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 130-141 (2001).</li><li>Green, D. R., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+functions+of+the+tumour+suppressor+p53.">Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53.</a> Nature. 458, 1127-1130 (2009).</li><li>Barton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+the+p53+tumour+suppressor+gene+in+human+pancreatic+cancer.">Abnormalities of the p53 tumour suppressor gene in human pancreatic cancer.</a> Br. J. Cancer. 64, 1076-1082 (1991).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Controle en EGFR gerichte gethioleerde gelatine nanodeeltjes werden bereid met een efficiënte DNA-inkapseling en stabiliteit. De deeltjesgrootte van al deze systemen in het bereik van 150-250 nm in diameter. Zeta potentieel heeft bewezen dat dit systeem is een licht negatief systeem. Met de SEM-analyse, de grootte van nanodeeltjes waren hetzelfde met Zetasizer resultaat. ESCA analyse kan bevestigen PEG en peptide oppervlaktemodificatie. Western blot analyse toonde aan dat PAnC-1-cellen een hoge EGFR expressie had en deze cellijn werd gebruikt voor de in vitro studies. Zowel de controle en de oppervlakte-gemodificeerde nanodeeltjes werden relatief minder cytotoxisch in PAnC-1 cellen ten opzichte van PEI. Cel mensenhandel studies toonden een snelle opname en plasmide release van EGFR-gerichte nanodeeltjes in PAnC-1 cellen. Levering van reporter plasmiden DNA uiten met EGFR-gerichte nanodeeltjes resulteerde in de hoogste niveaus van deGFP expressie ten opzichte van andere controles, met inbegrip Lipofectin-complex DNA. Met hetzelfde systeem, transfectie met wt-p53 plasmide veroorzaakt de downstream apoptotische route en geïnduceerde apoptose in een snelle PAnC-1 cellen. Deze voorlopige resultaten suggereren dat de EGFR-gerichte gethioleerde gelatine nanodeeltjes kan dienen als een veilige en efficiënte DNA-systeem voor de gentherapie als een behandeling voor pancreaskanker.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Type B gelatine, Bloom 225 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> 2-iminothiolaan hydrochloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6256 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP-N1 plasmide </td><td> Elim Biopharm </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Porf-hp53 E. coli </td><td> Invivogen </td><td> Porf-hp53 </td><td></td></tr><tr><td> Glyoxal oplossing (40wt.% in H 2 O) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 128465 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 410225-250G </td><td></td></tr><tr><td> Qia filter Plasmide Mega-kit </td><td> Qiagen </td><td> 12281 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman LE 80K Ultracentrifuge </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Freezone 6 Liter Console Freeze Dry Systems </td><td> Labconco </td><td> 7753020 </td><td></td></tr><tr><td> mPEG-SCM, MW 2000 Da </td><td> Laysan </td><td> mPEG-SCM-2K-1g </td><td></td></tr><tr><td> MAL-PEG-SCM, MW 2000 Da </td><td> Jenkem Technology </td><td> A5001-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zetasizer Nano </td><td> Malvern </td><td> Zetasizer Nano ZS </td><td></td></tr><tr><td> Hitachi 4800 field emission scanning electronen microscoop </td><td> Hitachi </td><td> S-4800 UHR FE-SEM </td><td></td></tr><tr><td> Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagens en kits </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin transfectiereagens </td><td> Invitrogen </td><td> 18292011 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech cellgro </td><td> 10 013 CM </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Mediatech cellgro </td><td> 50 020 PB </td><td></td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td></td></tr><tr><td> iBlot Droog Blotting System </td><td> Invitrogen </td><td> IB1001 </td><td></td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell en XCell II Blot Module Kit CE-markering </td><td> Invitrogen </td><td> EI0002 </td><td></td></tr><tr><td> Pierce ECL Western Blotting Substrate </td><td> Thermo Scientific </td><td> 32109 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) Systeem </td><td> Kodak </td><td> N / A </td><td>; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 AQ ueous Een Oplossing Cell Proliferation Assay (MTS) </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> BioTek SynergyHT plaat reader </td><td> BioTek </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Nanodrop 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Een stap RT-PCR kit </td><td> Qiagen </td><td> 210212 </td><td></td></tr><tr><td> Chromatine condensatie / membraanpermeabiliteit / Dead Cell Apoptosis Kit </td><td> Invitrogen </td><td> V23201 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-ONE Homogene caspase-3 / 7 Assay kit </td><td> Promega </td><td> G7790 </td><td></td></tr><tr><td> Hybaid PCR Sprint Thermal Cycler </td><td> Thermo Scientific </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> EGF receptor antilichaam </td><td> Celsignalering </td><td> 2232 </td><td></td></tr><tr><td> β-actine Antibody </td><td> Cell signaling </td><td> 4967 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-konijn IgG, HRP-linked Antibody </td><td> Cell signaling </td><td> 7074 </td><td></td></tr><tr><td> Muis monoklonaal antilichaam GFP </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB600-597 </td><td></td></tr><tr><td> Geit Polyklonale GFP antilichaam (alkalische fosfatase) </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB600-1502 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatase Ondergrond Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37620 </td><td></td></tr></tbody></table>

therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles

Meer dan 32.000 patiënten gediagnosticeerd met alvleesklierkanker in de Verenigde Staten per jaar en de ziekte gaat gepaard met zeer hoge sterfte 1. Dringende behoefte bestaat aan de ontwikkeling van nieuwe klinisch-vertaalbare therapeutische strategieën die kunnen verbeteren op de sombere overleven statistieken van patiënten met pancreaskanker. Hoewel gentherapie in kanker heeft aangetoond een enorme belofte, de grootste uitdaging is in de ontwikkeling van veilige en effectieve levering systeem, wat kan leiden tot aanhoudende transgenexpressie. Gelatine is een van de meest veelzijdige natuurlijke biopolymeer, veel gebruikt in voedingsmiddelen en farmaceutische producten. Eerdere studies in ons laboratorium hebben aangetoond dat type B gelatine kon fysieke DNA, die de dubbele helix structuur van het plasmide en verbeterde transfectie-efficiëntie bewaard gebleven bij de intracellulaire aflevering in te kapselen. Door thiolation van gelatine, kon de sulfhydrylgroepen geïntroduceerd worden in het polymeer en zou form disulfidebinding in nanodeeltjes, die het hele complex en een keer disulfidebinding stabiliseert is te wijten aan de aanwezigheid van glutathion in cytosol gebroken, zou payload worden vrijgegeven 2-5. Poly (ethyleenglycol) (PEG)-gemodificeerd Gens, wanneer het wordt toegediend in de systemische circulatie, biedt lange-circulatie tijden en bij voorkeur doelen om de tumor massa als gevolg van de hyper-doorlaatbaarheid van de neovasculatuur door de verbeterde doorlaatbaarheid en retentie effect 6. Studies hebben aangetoond over-expressie van de epidermale groeifactor receptor (EGFR) op PAnC-een menselijke pancreas adenocarcinoom cellen 7. Om actief alvleesklierkanker cellijn richten, EGFR specifieke peptide werd vervoegd op het deeltje oppervlak via een PEG-spacer. 8 De meeste anti-tumor gen-therapieën zijn gericht op het beheer van de tumor suppressor genen, zoals wild-type p53 (wt-p53), de pro-apoptotische functie in de cellen 9 herstellen </sup&gt;. De p53-mechanisme functioneert als een kritische signaalweg in cel groei, die apoptose reguleert, de celcyclus, de stofwisseling en andere processen 10. In alvleesklierkanker, de meeste cellen hebben mutaties in p53-eiwit, waardoor het verlies van de apoptotische activiteit. Met de introductie van wt-p53, kon de apoptose worden gerepareerd en verder triggers celdood in kankercellen 11. Gebaseerd op de bovenstaande reden, hebben we speciaal EGFR gericht peptide-gemodificeerde gethioleerde gelatine nanodeeltjes voor wt-p53-gen levering en geëvalueerd levering efficiëntie en transfectie in PAnC-1 cellen.

Watch this Scientific Journal Video about Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles at JoVE.com

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Type B gelatine-based ontworpen nanovectors systeem (Gens) is ontwikkeld voor systemische genafgifte en transfectie in de behandeling van alvleesklierkanker. Door modificatie met epidermale groeifactor receptor (EGFR) specifieke peptide op het oppervlak van nanparticles, kunnen ze gericht zijn op de EGFR-receptor en laat plasmide onder reducerende omgeving, zoals een hoge intracellulaire glutathion-concentraties.

Gene Levering en Transfectie in Human alvleesklierkankercellen met epidermale groeifactor receptor-gerichte Gelatine-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Het bestuderen van de stoichiometrie van de epidermale groeifactor receptor in intacte cellen met Correlatieve Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering van therapeutische siRNA het CZS gebruiken kationische en anionische liposomen

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Fabricage en Drug Delivery Toepassingen van Silk Nanodeeltjes

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Voorbereiding en karakterisering van nieuwe HDL-nabootsende nanodeeltjes voor ingewikkelde zenuwgroei Factor

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Ontwerpen van poreuze Silicon Films als dragers van de zenuw groeifactor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...