Name: therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles
Uploaded: 2012-01-04T13:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles at JoVE.com

Denne studien ble støttet av National Cancer Institute er Alliance i Nanoteknologi for Cancer Center for Cancer Nanoteknologi Excellence (CCNE) gi U54-CA151881.

<ol>
	<li>Vimalachandran, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+prevention+of+pancreatic+cancer.">Genetics and prevention of pancreatic cancer.</a> Cancer. Control. 11, 6-14 (2004).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+evaluation+of+thiol-modified+gelatin+nanoparticles+for+intracellular+DNA+delivery+in+response+to+glutathione.">Preparation and evaluation of thiol-modified gelatin nanoparticles for intracellular DNA delivery in response to glutathione.</a> Bioconjug. Chem. 16, 1423-1432 (2005).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)-modified+thiolated+gelatin+nanoparticles+for+glutathione-responsive+intracellular+DNA+delivery.">Poly(ethylene glycol)-modified thiolated gelatin nanoparticles for glutathione-responsive intracellular DNA delivery.</a> Nanomedicine. 3, 32-42 (2007).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiangiogenic+gene+therapy+with+systemically+administered+sFlt-1+plasmid+DNA+in+engineered+gelatin-based+nanovectors.">Antiangiogenic gene therapy with systemically administered sFlt-1 plasmid DNA in engineered gelatin-based nanovectors.</a> Cancer. Gene. Ther. 14, 488-498 (2007).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+pharmacokinetic+analysis+of+long-circulating+thiolated+gelatin+nanoparticles+following+systemic+administration+in+breast+cancer-bearing+mice.">Biodistribution and pharmacokinetic analysis of long-circulating thiolated gelatin nanoparticles following systemic administration in breast cancer-bearing mice.</a> J. Pharm. Sci. 96, 397-407 (2007).</li><li>Kaul, G., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeted+gene+delivery+using+poly(ethylene+glycol)-modified+gelatin+nanoparticles:+in+vitro+and+in+vivo+studies.">Tumor-targeted gene delivery using poly(ethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles: in vitro and in vivo studies.</a> Pharm. Res. 22, 951-961 (2005).</li><li>Bardeesy, N., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+biology+and+genetics.">Pancreatic cancer biology and genetics.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 897-909 (2002).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+peptide+ligand+of+epidermal+growth+factor+receptor+for+targeted+delivery+of+therapeutics.">Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics.</a> FASEB. J. 19, 1978-1985 (2005).</li><li>McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+gene+therapy:+fringe+or+cutting+edge.">Cancer gene therapy: fringe or cutting edge.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 130-141 (2001).</li><li>Green, D. R., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+functions+of+the+tumour+suppressor+p53.">Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53.</a> Nature. 458, 1127-1130 (2009).</li><li>Barton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+the+p53+tumour+suppressor+gene+in+human+pancreatic+cancer.">Abnormalities of the p53 tumour suppressor gene in human pancreatic cancer.</a> Br. J. Cancer. 64, 1076-1082 (1991).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Kontroll og EGFR målrettet thiolated gelatin nanopartikler var forberedt med effektive DNA innkapsling og stabilitet. Den partikkelstørrelser av alle disse systemene var i området 150-250 nm i diameter. Zeta potensial har vist at dette systemet er en litt negativ system. Med SEM analysen ble størrelsene av nanopartikler det samme med Zetasizer resultat. ESCA analyse kunne bekrefte PEG og peptid overflate modifikasjon. Western blot analyse viste at Panc-1 celler hadde en høy EGFR uttrykk nivåer og denne cellen linjen ble brukt til in vitro studier. Både kontroll og overflate-modifiserte nanopartikler var relativt mindre cytotoksiske i Panc-1 celler i forhold til PEI. Cell trafficking studier viste raske opptak og plasmid utgivelsen av EGFR målrettede nanopartikler i Panc-1 celler. Levering av reporter plasmider DNA uttrykker med EGFR målrettede nanopartikler resulterte i høyeste nivåene avGFP uttrykk i forhold til andre kontroller, inkludert Lipofectin-kompleksbundet DNA. Med det samme systemet, utløste transfeksjon med WT-p53 plasmid nedstrøms apoptotiske sti og indusert hurtig apoptose i Panc-1 celler. Disse foreløpige resultatene tyder på at EGFR målrettede thiolated gelatin nanopartikler kan tjene som en trygg og effektiv DNA levering system for genterapi som behandling for kreft i bukspyttkjertelen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Type B gelatin, 225 Bloom </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> 2-iminothiolane hydroklorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6256 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP-N1 plasmid </td><td> Elim Biopharm </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> pORF-hp53 E. coli </td><td> Invivogen </td><td> porf-hp53 </td><td></td></tr><tr><td> Glyoxal løsning (40wt.% i H 2 O) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 128465 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 410 225-250G </td><td></td></tr><tr><td> QIA filter Plasmid Mega kit </td><td> Qiagen </td><td> 12281 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman LE 80K Ultrasentrifuger </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FreeZone 6 liter Console Freeze Dry Systems </td><td> Labconco </td><td> 7753020 </td><td></td></tr><tr><td> MPEG-SCM, 2.000 MW Da </td><td> Laysan </td><td> MPEG-SCM-2K-1g </td><td></td></tr><tr><td> MAL-PEG-SCM, 2.000 MW Da </td><td> Jenkem Technology </td><td> A5001-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zetasizer Nano </td><td> Malvern </td><td> Zetasizer Nano ZS </td><td></td></tr><tr><td> Hitachi 4800 felt utslipp scanning elektronmikroskop </td><td> Hitachi </td><td> S-4800 UHR FE-SEM </td><td></td></tr><tr><td> Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagens og Kits </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin Transfeksjon Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 18292011 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech cellgro </td><td> 10 013 CM </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Mediatech cellgro </td><td> 50 020 PB </td><td></td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td></td></tr><tr><td> iBlot Dry blotting System </td><td> Invitrogen </td><td> IB1001 </td><td></td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell og XCell II Blot Module Kit CE-merket </td><td> Invitrogen </td><td> EI0002 </td><td></td></tr><tr><td> Pierce ECL Western blotting Substrat </td><td> Thermo Scientific </td><td> 32109 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Digital X-ray Prøvetaking (DxS) System </td><td> Kodak </td><td> N / A </td><td>; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 AQ ueous Ett Solution celleproliferasjon analyse (MTS) </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> BioTek SynergyHT plateavleseren </td><td> BioTek </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Nanodrop 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Ett-trinns RT-PCR kit </td><td> Qiagen </td><td> 210212 </td><td></td></tr><tr><td> Kromatin Kondens / Membran Permeabilitet / døde celler Apoptose Kit </td><td> Invitrogen </td><td> V23201 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-ONE Homogen caspase-3 / 7 Assay kit </td><td> Promega </td><td> G7790 </td><td></td></tr><tr><td> Hybaid PCR Sprint Thermal Cycler </td><td> Thermo Scientific </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> EGF reseptor antistoff </td><td> Cellsignalering </td><td> 2232 </td><td></td></tr><tr><td> β-Actin antistoff </td><td> Cellesignalisering </td><td> 4967 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-kanin IgG, HRP-koblet antistoff </td><td> Cellesignalisering </td><td> 7074 </td><td></td></tr><tr><td> Monoklonalt antistoff GFP </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB600-597 </td><td></td></tr><tr><td> Goat polyklonale GFP antistoff (alkalisk fosfatase) </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB600-1502 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatase Substrat Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37620 </td><td></td></tr></tbody></table>

therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles

Mer enn 32.000 pasienter er diagnostisert med kreft i bukspyttkjertelen i USA per år og sykdommen er forbundet med svært høy dødelighet 1. Påtrengende behov eksisterer for å utvikle nye klinisk-oversettbare terapeutiske strategier som kan forbedre den dystre overlevelse statistikk for kreft i bukspyttkjertelen pasienter. Selv om genterapi i kreft har vist en enorm løfte, er den viktigste utfordringen i utviklingen av trygg og effektiv levering system, som kan føre til vedvarende transgenet uttrykk. Gelatin er et av de mest allsidige naturlige biopolymer, mye brukt i næringsmidler og farmasøytiske produkter. Tidligere studier fra vårt laboratorium har vist at type B gelatin kan fysisk innkapsle DNA, som bevarte supercoil strukturen av plasmid og forbedret transfeksjon effektivitet ved intracellulære levering. Ved thiolation av gelatin, kunne sulfhydryl gruppene bli introdusert inn i polymer og ville fOrm disulfide obligasjon innenfor nanopartikler, som stabiliserer hele komplekset og når disulfide bindingen er brutt på grunn av tilstedeværelsen av glutation i cytosol, ville nyttelast bli utgitt 2-5. Poly (etylenglykol) (PEG)-modifisert Gens, når det gis i den systemiske sirkulasjonen, gir lang sirkulasjon ganger og fortrinnsvis mål til svulsten masse på grunn av hyper-permeabilitet av neovasculature av den forbedrede permeabilitet og oppbevaring effekt seks. Studier har vist over-uttrykk for epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) på Panc-1 humane bukspyttkjertelen adenocarcinoma celler 7. For å aktivt å målrette kreft i bukspyttkjertelen cellelinje, var EGFR spesifikke peptid konjugert på partikkel overflaten gjennom en PEG spacer. 8 De fleste anti-tumor genterapi er fokusert på administrasjon av tumorsuppressorgener som villtype p53 (WT-p53), for å gjenopprette den pro-apoptotiske funksjonen i cellene 9 </sup&gt;. Den p53 mekanismen fungerer som en kritisk signalveien i cellevekst, som regulerer apoptose, cellesyklus arrest, metabolisme og andre prosesser 10. I kreft i bukspyttkjertelen, de fleste celler har mutasjoner i p53 protein, forårsaker tap av apoptotiske aktiviteten. Med introduksjonen av WT-p53, kan apoptose repareres og videre utløser celledød i kreftceller 11. Basert på ovennevnte begrunnelse, har vi designet EGFR rettet peptid-modifisert thiolated gelatin nanopartikler for WT-p53 genet levering og evaluert levering effektivitet og transfeksjon i Panc-1 celler.

Watch this Scientific Journal Video about Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles at JoVE.com

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Type B gelatin-basert konstruert nanovectors system (Gens) ble utviklet for systemisk genet levering og transfeksjon i behandling av bukspyttkjertelkreft. Ved modifisering med epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) spesifikke peptid på overflaten av nanparticles, kunne de target på EGFR reseptor og slipp plasmid henhold redusere miljø, slik som høye intracellulære glutation konsentrasjoner.

Gene Levering og Transfeksjon i Human kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp av epidermal vekstfaktorreseptor målrettede Gelatin-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering av polymere Gene levering Nanopartikler av nanopartikler Tracking Analysis og High-throughput flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmering stamceller for Therapeutic Angiogenese Bruke biologisk nedbrytbart Polymer Nanopartikler

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Electro Growth Factor Releasing Microspheres inn i fibre Stillas

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studerer Støkiometrien av epidermal vekstfaktor reseptor i intakte celler bruker korrelative Mikros

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering av Terapeutisk siRNA til CNS Bruke kationiske og anioniske liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolytkompleks for Heparin Binding Domain osteogene Growth Factor Levering

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Produksjon og levering av legemidler Anvendelser av Silk Nanopartikler

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Forberedelse og karakterisering av nye HDL-imiterende nanopartikler for nervvekstfaktorkapsling

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Utforme porøse Silicon filmer som bærere av Nerve vekst faktor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...