Name: therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles
Uploaded: 2012-01-04T13:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles at JoVE.com

Denna studie stöddes av National Cancer Institute har alliansen i Nanoteknik för Cancer Center for Cancer Nanoteknik Excellence (CCNE) bevilja U54-CA151881.

<ol>
	<li>Vimalachandran, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+prevention+of+pancreatic+cancer.">Genetics and prevention of pancreatic cancer.</a> Cancer. Control. 11, 6-14 (2004).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+evaluation+of+thiol-modified+gelatin+nanoparticles+for+intracellular+DNA+delivery+in+response+to+glutathione.">Preparation and evaluation of thiol-modified gelatin nanoparticles for intracellular DNA delivery in response to glutathione.</a> Bioconjug. Chem. 16, 1423-1432 (2005).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)-modified+thiolated+gelatin+nanoparticles+for+glutathione-responsive+intracellular+DNA+delivery.">Poly(ethylene glycol)-modified thiolated gelatin nanoparticles for glutathione-responsive intracellular DNA delivery.</a> Nanomedicine. 3, 32-42 (2007).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiangiogenic+gene+therapy+with+systemically+administered+sFlt-1+plasmid+DNA+in+engineered+gelatin-based+nanovectors.">Antiangiogenic gene therapy with systemically administered sFlt-1 plasmid DNA in engineered gelatin-based nanovectors.</a> Cancer. Gene. Ther. 14, 488-498 (2007).</li><li>Kommareddy, S., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+pharmacokinetic+analysis+of+long-circulating+thiolated+gelatin+nanoparticles+following+systemic+administration+in+breast+cancer-bearing+mice.">Biodistribution and pharmacokinetic analysis of long-circulating thiolated gelatin nanoparticles following systemic administration in breast cancer-bearing mice.</a> J. Pharm. Sci. 96, 397-407 (2007).</li><li>Kaul, G., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeted+gene+delivery+using+poly(ethylene+glycol)-modified+gelatin+nanoparticles:+in+vitro+and+in+vivo+studies.">Tumor-targeted gene delivery using poly(ethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles: in vitro and in vivo studies.</a> Pharm. Res. 22, 951-961 (2005).</li><li>Bardeesy, N., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+biology+and+genetics.">Pancreatic cancer biology and genetics.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 897-909 (2002).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+peptide+ligand+of+epidermal+growth+factor+receptor+for+targeted+delivery+of+therapeutics.">Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics.</a> FASEB. J. 19, 1978-1985 (2005).</li><li>McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+gene+therapy:+fringe+or+cutting+edge.">Cancer gene therapy: fringe or cutting edge.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 130-141 (2001).</li><li>Green, D. R., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+functions+of+the+tumour+suppressor+p53.">Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53.</a> Nature. 458, 1127-1130 (2009).</li><li>Barton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+the+p53+tumour+suppressor+gene+in+human+pancreatic+cancer.">Abnormalities of the p53 tumour suppressor gene in human pancreatic cancer.</a> Br. J. Cancer. 64, 1076-1082 (1991).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Kontroll och EGFR riktade thiolated gelatin nanopartiklar var beredda med effektiva DNA inkapsling och stabilitet. Partiklar av alla dessa system var i intervallet 150-250 nm i diameter. Zeta potential har visat att detta system är en svagt negativ system. Med SEM analys, var storleken på nanopartiklar samma sak med Zetasizer resultat. ESCA analys kunde bekräfta PEG och peptid ytmodifiering. Western blot-analys visade att Panc-1 celler hade en hög EGFR-uttryck och denna cellinje användes för in vitro-studier. Både kontroll och ytan modifierade nanopartiklar var relativt mindre cytotoxiska i Panc-1 celler jämfört med PEI. Cell människohandel studier visade snabbt upptag och plasmid frisättning av EGFR-riktade nanopartiklar i Panc-1 celler. Leverans av reporter plasmider DNA uttrycker med EGFR-riktade nanopartiklar resulterade i högstaGFP uttryck i förhållande till andra kontroller, inklusive Lipofectin-komplexbundet DNA. Med samma system, utlöst transfektion med WT-p53 plasmid nedströms apoptotiska vägen och inducerad snabb apoptos i Panc-1 celler. Dessa preliminära resultat tyder på att EGFR-riktade thiolated gelatin nanopartiklar kan fungera som ett säkert och effektivt DNA leveranssystem för genterapi som behandling för cancer i bukspottkörteln.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Typ B gelatin, Bloom 225 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> 2-iminothiolane hydroklorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6256 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP-N1 plasmid </td><td> Elim Biopharm </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> pORF-hp53 E. coli </td><td> Invivogen </td><td> porf-hp53 </td><td></td></tr><tr><td> Glyoxal lösning (40wt.% i H 2 O) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 128.465 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 410.225-250G </td><td></td></tr><tr><td> QIA filter Plasmid Mega kit </td><td> Qiagen </td><td> 12.281 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman LE 80K ultracentrifugen </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Freezone 6 Liter Console Freeze Dry Systems </td><td> Labconco </td><td> 7753020 </td><td></td></tr><tr><td> MPEG-SCM, MW 2000 Da </td><td> Laysan </td><td> MPEG-SCM-2K-1g </td><td></td></tr><tr><td> MAL-PEG-SCM, MW 2000 Da </td><td> Jenkem Teknik </td><td> A5001-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zetasizer Nano </td><td> Malvern </td><td> Zetasizer Nano ZS </td><td></td></tr><tr><td> Hitachi 4800 fältemission svepelektronmikroskop </td><td> Hitachi </td><td> S-4800 UHR FE-SEM </td><td></td></tr><tr><td> Quant-IT PicoGreen dsDNA Reagens och satser </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin Transfektion Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 18292011 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech cellgro </td><td> 10 013 CM </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Mediatech cellgro </td><td> 50 020 PB </td><td></td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23.225 </td><td></td></tr><tr><td> iBlot Torr Blotting System </td><td> Invitrogen </td><td> IB1001 </td><td></td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell och XCell II blot Module Kit CE-märkning </td><td> Invitrogen </td><td> EI0002 </td><td></td></tr><tr><td> Pierce ECL Western blotting Substrat </td><td> Thermo Scientific </td><td> 32.109 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Digital röntgen Specimen (DXS) System </td><td> Kodak </td><td> N / A </td><td>; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 AQ ueous En standardlösning Cell Proliferation Assay (MTS) </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> Biotek SynergyHT plattläsarens </td><td> Biotek </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Nanodrop 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Ett steg RT-PCR kit </td><td> Qiagen </td><td> 210.212 </td><td></td></tr><tr><td> Kromatin Kondens / permeabilitet / Dead apoptos Kit </td><td> Invitrogen </td><td> V23201 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-ONE Homogen caspase-3 / 7 Assay kit </td><td> Promega </td><td> G7790 </td><td></td></tr><tr><td> Hybaid PCR Sprint Värmecykel </td><td> Thermo Scientific </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> EGF-receptor antikroppsinduktion </td><td> Cellsignalering </td><td> 2232 </td><td></td></tr><tr><td> β-Actin Antibody </td><td> Cellsignalering </td><td> 4967 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-kanin IgG, HRP-linked Antibody </td><td> Cellsignalering </td><td> 7074 </td><td></td></tr><tr><td> Monoklonal antikropp GFP </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB600-597 </td><td></td></tr><tr><td> Goat Polyklonala GFP antikropp (alkaliskt fosfatas) </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB600-1502 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatassubstratlösningen Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37.620 </td><td></td></tr></tbody></table>

therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles

Mer än 32.000 patienter får diagnosen pankreascancer i USA varje år och sjukdomen är förknippad med mycket hög dödlighet 1. Akut behov finns för att utveckla nya kliniskt översättas terapeutiska strategier som kan förbättra den dystra överlevnad statistiken för patienter med pankreascancer. Även om genterapi vid cancer har visat en oerhörd löfte är den stora utmaningen i utvecklingen av säkra och effektiva leveranssystem, vilket kan leda till varaktig transgenen uttryck. Gelatin är ett av de mest mångsidiga naturliga biopolymerer, ofta används i livsmedel och läkemedel. Tidigare studier från vårt laboratorium har visat att typ B gelatin kunde fysiska kapsla in DNA, som bevarade supercoiled struktur plasmiden och förbättrad transfektion effektivitet vid intracellulär leverans. Genom thiolation av gelatin, kunde sulfhydryl grupper föras in i polymeren och skulle fOrm disulfide obligationer inom nanopartiklar, som stabiliserar hela det komplexa och när disulfide obligation är bruten på grund av förekomsten av glutation i cytosolen, skulle nyttolast släppas 2-5. Poly (etylenglykol) (PEG)-modifierad Gens, när det ges i den systemiska cirkulationen, ger lång cirkulation tider och företrädesvis mål för att tumören massa på grund av den hyper-permeabiliteten i kärlnybildningens genom förbättrad permeabilitet och behålla effekten 6. Studier har visat överdrivet uttryck för epidermal tillväxtfaktor (EGFR) på Panc-1 humana celler i bukspottkörteln adenocarcinom 7. För att aktivt rikta bukspottkörteln linje cancercell var EGFR specifik peptid konjugerade på partikel ytan genom en PEG spacer 8. De flesta anti-tumör genterapi är inriktade på förvaltning av tumörsuppressorgener, såsom vildtyp p53 (WT-p53), för att återställa pro-apoptotiska funktion i cellerna 9 </sup&gt;. P53-mekanismen fungerar som en viktig signalväg i celltillväxt, som reglerar apoptos, cellcykelarrest, metabolism och andra processer 10. I bukspottkörtelcancer, de flesta celler har mutationer i p53, vilket leder till förlust av apoptotiska aktivitet. Med införandet av WT-p53 kan apoptos repareras och ytterligare triggers celldöd i cancerceller 11. Baserat på ovanstående grund, har vi utformat EGFR riktar peptid-modifierade thiolated gelatin nanopartiklar för WT-p53-genen leverans och utvärderas leverans effektivitet och transfektion i Panc-1 celler.

Watch this Scientific Journal Video about Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles at JoVE.com

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Typ B gelatin-baserade konstruerad nanovectors system (Gens) var utvecklad för systemisk gen leverans och transfektion vid behandling av cancer i bukspottskörteln. Genom modifiering med epidermal tillväxtfaktor (EGFR) särskilda peptid på ytan av nanparticles kunde de rikta om EGFR-receptorn och släpp plasmid i reducerande miljö, exempelvis höga intracellulära glutation koncentrationer.

Gene Delivery och Transfektion i mänskliga celler bukspottkörtelcancer med Epidermal Growth Factor Receptor-riktade Gelatin-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmerings stamceller i terapeutiska Angiogenes använda biologiskt nedbrytbara polymera nanopartiklar

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Electro tillväxtfaktor Släpper mikrosfärer i Fiber Ställningar

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studie stökiometrin hos receptorn för epidermal tillväxtfaktor i intakta celler genom att använda Korrelat Mikroskopi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Avgivning av terapeutiska siRNA mot CNS Använda katjoniska och anjoniska liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolytkomplex för Heparin Binding Domain osteogent Growth Factor Leverans

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Tillverkning och Drug Delivery Tillämpningar av Silk Nanopartiklar

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Framställning och karaktärisering av nya HDL-imiterande nanopartiklar för nervtillväxtfaktorkapsling

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Utforma porösa Silicon filmer som bärare av nervtillväxtfaktor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...