Name: production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas
Uploaded: 2012-05-31T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Knut og Alice Wallenbergs Foundation. Hele stabe af det humane protein Atlas centre i Uppsala, Stockholm og Indien er anerkendt for deres indsats for at skabe det humane protein Atlas. Forfatterne ønsker at især takke Frank Hammar og Sofie Gustafsson for at få hjælp med fotos og Elene Karlberg for hjælp med TMA produktionen, når du filmer.

1. Sådan Forbered Væv for Tissue Microarray Produktion (Animation 1) <ol><li> Vælg relevant formalin fast paraffinindlejret materiale (væv eller celle prøver), herunder tilsvarende hæmatoxylin farvede vævssnit. </li><li> Markere relevante område på vævssnittet. Det anbefales, at en frisk skåret hematoxylin farvet snit svarende til paraffin blok. </li><li> Udforme den template der anvendes til TMA produktion. Tilfældig prøverne i skabelonen for at undgå artefakter som følge af tekniske problemer, såsom dækning af antistoffet over hele TMA sektion og koblinger problemer. Tilføje yderligere orientering markører til skabelonen for orientering. </li><li> Organisere væv ifølge skabelonen. </li></ol> 2. Manuel Tissue Microarray Produktion (Essential til at filme) <ol><li> For at kunne opnå en standardiseret længde af væv kernerne, markerer stiletten fx 4,5 mm (fig. 2). Guidelines for afstanden mellem prøven centre: kernestørrelse 0,6 mm - 0,8 til 1,0 mm centrale størrelse 1,0 mm - 1,8-2,0 mm kernestørrelse 1,5 mm - 2,0 til 3,0 mm kernestørrelse 2,0 mm - 2,5 til 4,0 mm Det anbefales at lade 2,5-3,0 mm margen på hver side af paraffin blokken for at undgå revnedannelse i paraffin. </li><li><ol class="lalpha"><li> Montere de udvalgte stemplerne skal anvendes. Start med at løsne de sekskantede skruer, der holder punch i stedet. Stemplet er korrekt placeret, når rillen i stemplet navet er fast anbragt mod metalstang i plast v-blokken. Spænd skruerne, og sørg for at kanten af ​​metallet klip er vandret. </li><li> Modtageren punch (markeret med grøn og rød, der er specifikke for distributør) skal placeres til venstre. Donorstemplet (markeret med grøn og blå, som er specifikt for distributøren), som har en lidt større diameter, bør placeres til højre (fig. 3). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Bevæge stemplerne langs x-og y-akser ved hjælp af XY justeringsknapperne. Ret drejeknap bevæger stemplerne langs x-aksen og den venstre indstillingsknappen bevæger stemplerne langs y-aksen. Der er et digitalt mikrometer udlæsning på begge justeringsgrebene. Disse aktiveres, når du flytter knapperne. </li><li> Nulstil → tryk på ZERO / ABS-knappen. Skift mellem inches og mm → tryk på IN / mm knappen. Mellemrummet mellem hullerne være 2,0 mm (målt mellem centrene af hullerne) ved anvendelse af en 1 mm dorn til en 9x8 skabelon. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> For at sikre, at du ikke skubber det punch for langt ned i blokken, rammer kassetten og ødelægger punch, sætter en kassette uden paraffin i holderen og sæt den nederste position af modtageren punch til 1 mm over bunden af ​​kassetten ved hjælp af dybdeanslaget skruenøverste venstre hjørne af Z-føring (figur 3). </li><li> Sæt modtageren blokken i holderen og bruge den mindste skruetrækker til at fastgøre skruerne. Fastspænd ikke skruerne for at stramme eller paraffin kunne bryde løs fra kassetten. </li><li> Skubbe modtagerstemplet nedadgående cirka 5 mm i modtagerblokken og anvende håndtaget i stemplet for at rotere stemplet frem og tilbage en gang (figur 3). Hullet skal være 5 mm dyb, når skubber dornen så langt ned i blokken som muligt. </li><li> Aflaste nedadgående skubbe trykket langsomt, således at fjedrene kan bevæge stemplet opad. Brug stilet til at tømme punch og kassér paraffin kernen. </li></ol></li><li> Bevæge revolveren til at skifte til donorstemplet (figur 3). </li><li> Anbring donorblokken bro med donorblokken over modtagerblokholderen (figur 3). </li><li><ol class="lalpha"><li> Skub donor punch i det valgte område af donorblokken. Anvende en tilsvarende hematoxylin og eosin-farvet lysbillede, hvor regionen af ​​interesse er blevet markeret at lokalisere væv, der skal udtages. Manuelt holde donorblokken på plads med din venstre hånd og skubbe punch med din højre hånd. Bemærk, at du ikke skal skubbe på stiletten. Den dybdeanslag ikke blokere slag bevægelse i den rigtige position for donorblokken, så det er vigtigt, at du holder op med at skubbe, når det andet mærke er synlig på stiletten. </li><li> Drej håndtaget på punch gang (Figur 3). Langsomt frigive den nedadgående pres mens du stadig holder donorblokken på donorblokken broen. </li><li> Den donorvæv er fortrinsvis stanses 0,5 mm kortere end modtageren kernen. Denne proces vil sikre en justerbar tilpasning af kernerne på modtageren blokken overfladen, undgå tab af værdifuld repræsentant væv. </li></ol></li><li> Fjernes broen og donorblokken. GørKontroller at donorstemplet flugter med hullet, der blev fremstillet tidligere (punkt 4). Du skal justere slag position ved hjælp af de opstillede skruerne, hvis donorudstansningsindretningen og hullet i modtagerens blokken ikke er justeret. </li><li> Forsigtigt skubbe stemplet nedad, indtil dens spids når toppen af ​​hullet i modtagerblokken. Mens du holder denne position, skal du bruge stiletten at tømme vævet kernen i hullet. Kernens overflade bør være på linie med blokken overflade. </li><li> Flyt tårnet tilbage til modtageren punch. </li><li> Flyt til næste position med XY justeringsgrebene. </li><li> Gentag fra punkt 4c over, indtil sættet er komplet. </li><li> Når hele modtageren blokken er færdig, skal du løsne skruerne i modtagerblokholderen. Bag blok i 42 ° C i 40 minutter. Satte blok med sektionering vender nedad på et objektglas. Anbring objektglas med blokken på toppen af ​​et reagensglas holder (eller anden passende konstruktion) og anbringes i tHan ovn. Efter bagning fjernes reagensglasset holderen ud af ovnen og flade overflade af blokken ved forsigtigt at stryge objektglasset. </li><li> Placere blokken med objektglasset på en køleplade i 10 minutter. For at sikre repræsentativt væv hele TMA en kvalitetskontrol på hver 50 th sektion udføres. </li></ol> 3. Sådan § TMA&#39;erne (Animation 2) <ol><li> Skær 4 um tykke sektioner ved hjælp af en mikrotom med § transfer system (HM 355S, microM). Systemet kan bruges med alle aktuelle roterende mikrotomer. Systemet består af et blad bærer med en integreret transfer bro, et opvarmet vandbad, og en styreenhed. Fra bladet afsnittene glider på den våde overførsel overfladen via overførsel bro i vandbadet. </li><li> Sektionerne skal tages op af vandbadet umiddelbart efter at de har strakt ud, for at undgå smeltning af følsomme væv pletter (f.eks lipidrige væv såsom bryst og hjerne). Place afsnittet om en SuperFrost objektglas. Den tid sektionerne kan efterlades i vandet, afhænger af typen af ​​paraffin voks anvendes, og vandtemperaturen. Vores laboratorium anvendelse paraffinvoks fra HistoLab Products AB, der har et smeltepunkt på 56-58 ° C, og vi anbefaler en vandbadstemperatur på 37-39 ° C. </li><li> Anbring objektglassene i et dias holder til tørring i stuetemperatur (RT) i løbet af natten. </li><li> Objektglassene bages ved 50 ° C i 12-24 timer. Ved hjælp af en microtom uden STS du nødt til at transportere afsnittet fra bladet til et vandbad manuelt ved hjælp af fx en børste. </li></ol> 4. Test og Titrering Procedure for Immunhistokemi (Animation 3) Hvert antistof udsættes for en standardiseret test under anvendelse af specielt designede TMA&#39;erne indeholdende en blanding af væv og forskellige celletyper. Målet er at vurdere en individuel og optimeret immunfarvning protokol for hvert antistof. Indledningsvis en fortynding baseret på myreibody stamkoncentration på det primære antistof afprøves. Resultatet af denne test farvning bruges til at vejlede yderligere fortyndinger og optimering af protokollen. <ol><li> Afparaffinering og hydratisering i xylen og gradueret ethanol til destilleret vand udføres før immunfarvning. </li><li> Et blokerende trin for at standse endogen peroxidase udføres i 0,3% H2O 2 i 95% ethanol i 5 minutter. </li><li> Varmeinduceret epitopgenfinding (Hier) udføres i et databasesystem puffer pH 6, med et tryk kedel (Decloaking kammer, Biocare Medical) som varmekilde i 4 minutter ved 125 ° C. Efter afsluttet kogning objektglas forblive i trykket kedlen og får lov at afkøle til 90 ° C. Den totale behandlingstid for Hier er cirka 45 minutter. </li><li> Hvis der ikke afgørende resultat er opnået i den indledende test, der yderligere undersøgelser foretages på basis af observerede farvningsmønster 5 6. En pilotundersøgelse inden for HPA high-throughput set-up, visteat den mest nyttige antigenet genfinding, hvor Hier pH 6, men andre metoder til at hente såsom præ-inkubering med proteinase, mikrobølge og koger i puffer med højere eller lavere pH kan naturligvis anvendes. Ved at ændre IHC tilstand fx at ændre antistof inkubationstider, antistof fortyndinger og diaminobenzidin (DAB) inkubationstider på farvningsmønster kan give mere afgørende resultater. </li></ol> 5. Farvning Program, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Alle inkubationer udføres ved stuetemperatur, og denne protokol kan også anvendes i en manuel indstilling af de samme reagenser. <ol><li> Skylning i vaskebuffer. </li><li> Inkubation med Ultra V blok i 5 minutter. </li><li> Skylning i vaskebuffer. </li><li> Inkubation med primært antistof i 30 minutter. </li><li> Skylning i vaskepuffer (x2). </li><li> Inkubation med mærket peberrodsperoxidase-polymer i 30 minutter. </li><li> Skylning i vaskepuffer (x2). </li><li> Udvikling i DAB-løsningi 10 minutter. </li><li> Skylning i vaskepuffer (x2). </li><li> Modfarvning i Mayers hematoxylin i 5 minutter *. Ved anvendelse af en progressiv farvningsmetode (f.eks Mayers hematoxylin) intensiteten afhænger af tid og ingen differentiering er påkrævet. En regressive farvningsmetode f.eks Harris hematoxylin kræver differentiering til fjernelse af overskydende farvestof fra væv for at forstærke en struktur. </li><li> Skylning i ledningsvand *. </li><li> Skylning i lithiumcarbonat vand, fortyndet 1:05 fra mættet opløsning i 1 minut *. </li><li> Skylning i ledningsvand i 5 minutter *. </li><li> De slides er dehydreret i graduerede ethanol og dias er dækglas (Pertex, Histolab) </li></ol> Alle reagenser er anvendt i et volumen på 300 pi pr objektglas. * Trin 10-14 er udført i en histostaining instrument (Autostainer XL, Leica) og dækglas er desuden udført i et coverslipper system (Automated glas coverslipper CV5030, Leica). 6. Hvordan skal der scanneset dias Den metode til scanning af dias er afhængig af den digitale scanneren udnyttes, denne protokol kun definerer, hvordan du scanner et dias ved hjælp af automatiserede scanningssystem Aperio XT (Aperio Technologies). I det humane protein Atlas opsætning 20x forstørrelse for væv og 40x for celler. Skanningsudstyr kunne støde fokus problemer på grund af heterogeniteten af ​​vævet og antallet af forskellige væv, der indgår i en TMA. <ol><li> Rengør objektglasset mod snavs, lim og tjek for luftbobler mellem dækglas og afsnittet. I tilfælde af luftbobler remount diaset. </li><li> Sæt dias i et rack og placer rack i den digitale scanner. Den tid til at scanne en TMA ved 20x forstørrelse er cirka 6 minutter. En software fra Aperio anvendes til at vælge området af interesse. Fokuspunkt valg foretages automatisk i softwaren. Manuel valg af scanningsområde og fokuspunkter er også muligt. </li><li> Når billedet hsom er genereret den kan bruges til evaluering og kommentering af IHC farvning. Billeder forblive som et resultat fil af eksperimentet og kan distribueres til kolleger for drøftelser og yderligere anvendes til offentliggørelse af data. Billederne kan ses i en frit tilgængelig software fra Aperio. </li></ol> 7. Sådan Søg efter dit yndlings protein i det humane protein Atlas <ol><li> Gå til <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> Indtast navnet på dit yndlings protein, Ensembl id, UniProt tiltrædelse nummer eller HGNC navn fx insulin. </li><li> Indtast oversigtsside og rul ned til normalt væv og organer resumé. Oversigten viser protein-ekspression i bugspytkirtlen. </li><li> Klik på &quot;mere væv data&quot;. Du indtaster de normale væv, se hvor du kan se alle væv omfattede sorteret efter organ. </li><li> Klikke på bugspytkirtlen at se IHC resultaterne for 3-antistoffer rettet mod det samme protein. For at se en high-opløsning i bugspytkirtlen klik på billedet. </li><li> Yderligere oplysninger om protein udtryk i kræftvæv, celler og yderligere validering af data i det humane protein Atlas kan findes ved at søge det humane protein Atlas hjemmeside. </li></ol> 8. Repræsentative resultater Animation 1. Hvordan forbereder væv til væv microarray produktion. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Klik her for at se Animation 1</a> . Animation 2. Sådan afsnit TMA&#39;erne. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Klik her for at se Animation 2</a> . Animation 3. Den immunhistokemi Teknikken er beskrevet. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Klik her for at se Animation 3</a> .<img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> Figur 1. Overordnet arrangement af den proces, inden det humane protein Atlas Uppsala. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> Figur 2. Donor stilet markeret for standardiseret længden af væv kerner fx 4,5 mm. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> Figur 3. Manual væv microarrayer. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> Figur 4. Eksempler på forskellig kvalitet af producerede TMA&#39;erne. (A) en lige og korrekt afstemt TMA med tilstrækkelig plads mellem rækkerne og søjlerne samt til kanten af ​​paraffin. (B) En TMA med nogle af kernerne for tæt på kanten resulterer i mulige problemer ved sektionering. (C) En TMA, der er bagt i too lang resulterer i en sammenklappet TMA uden den korrekte template. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> Figur 5. Hæmatoxylin og eosin-farvede TMA&#39;erne. (A) En passende skåret sektion med ligekædede og tilpasset kolonner og rækker. Ved hjælp af en dårlig eller beskidt blad kunne resultere i opsplitning (B) eller komprimerede sektioner (C). <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> Figur 6. Titrering af antistoffer. (A) reaktion center celler i lymfeknuder viser et optimalt titreret antistof resulterede i en specifik cytoplasmatisk farvning (vist i brun) uden baggrund. (B) vævssnittet viser svag farvning. Negativ eller svag farvning findes, når koncentrationen af ​​primære antistof er for lav, eller hvis målet proteinet ikke er til stede i immunofarvede væv. (C) vævssnittet er overstained grund af brugen af ​​for høj koncentration af primært antistof. DArk farve resulterer i vanskeligheder bestemmer den subcellulære lokalisering som følge af at brede sig, krydsreaktivitet og falsk positivitet.

<ol>
	<li>Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitumor+(sausage)+tissue+block:+novel+method+for+immunohistochemical+antibody+testing.">The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing.</a> Lab Invest. 55, 244-244 (1986).</li><li>Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat. Med. 4, 844-844 (1998).</li><li>Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genecentric+Human+Protein+Atlas+for+expression+profiles+based+on+antibodies.">A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies.</a> Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).</li><li>Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+protein+atlas+for+normal+and+cancer+tissues+based+on+antibody+proteomics.">A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).</li><li>Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+tissue+fixatives+on+morphology+and+antibody-based+protein+profiling+in+tissues+and+cells.">The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).</li><li>Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+monospecific+antibodies:+a+comparison+study+with+commercial+analogs+using+immunohistochemistry+on+tissue+microarrays.">Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).</li><li>Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+tissue+profiling+as+a+tool+for+clinical+proteomics.">Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics.</a> Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).</li><li>Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Protein+Atlas+-+a+tool+for+pathology.">The Human Protein Atlas - a tool for pathology.</a> J. Pathol. 216, 387-387 (2008).</li><li>Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+expression+in+cell+microarrays:+a+tool+for+antibody-based+proteomics.">Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).</li><li>Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+for+protein+profiling+in+cell+microarrays+using+automated+image+analysis.">A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis.</a> Proteomics. 7, 2142 (2007).</li><li>Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+expression+of+the+RNA-binding+protein+RBM3+is+associated+with+an+improved+clinical+outcome+in+breast+cancer.">Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer.</a> Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).</li><li>Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB2+in+combination+with+cytokeratin+20+identifies+over+95%+of+all+colorectal+carcinomas.">SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).</li><li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+new+technology+for+amplification+of+tissue+resources.">Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources.</a> Cancer J. 7, 24 (2001).</li><li>Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape+transfer+sectioning+of+tissue+microarrays+introduces+nonspecific+immunohistochemical+staining+artifacts.">Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts.</a> Biotech. Histochem. , (2010).</li><li>UniProt. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 39, D214 (2011).</li><li>Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+knowledge-based+Human+Protein+Atlas.">Towards a knowledge-based Human Protein Atlas.</a> Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).</li><li>Leong, A. S., Leong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+in+immunohistology.">Standardization in immunohistology.</a> Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).</li></ol>

Vi har intet at afsløre.

Immunhistokemi er langt det mest anvendte program til TMA&#39;erne. Kombinationen af IHC og TMA&#39;erne kan bruges i flere forskellige sammenhænge, ​​fx high-throughput screening af protein udtryk mønstre i væv 7 8 og celler 9 10, biomarkør opdagelse undersøgelser baseret på vævsprøver fra store patientkohorter 11 12 og mere grundlæggende tumor biologi undersøgelser, herunder forskellige fænotyper / genotyper, differentiering etaper, progression og metastase 13. En fordel ved anvendelse TMA&#39;erne at materiale fra store grupper kan analyseres på én gang, begge sparer biologisk materiale og sikre en mere reproducerbare eksperimenter. Endvidere er anvendelsen af ​​TMA-teknologi sparer reagens omkostninger og laboratorie behandlingstid. Som en TMA kun indeholder en begrænset mængde væv, væv heterogenitet er et problem. Afhængig af væv og spørgsmål, der skal behandles, kan flere prøver være nødvendigt fra samme specimen. For tumorvæv, er anvendelsen af to til fire kerner fra hver prøve anbefales det har vist sig at resultere i en høj grad af nøjagtighed i repræsentation af hele vævssnit 13 14. Afhængigt væv sammensætning diameteren af ​​stemplerne (i området fra 0,6 mm til 2 mm) kan justeres. Væv er komplekse og består af to forskellige celletyper, strukturer og ekstra-cellulær matrix. Sammensætningen af ​​hver forskellig vævstype indeholdende variabel mængde fedt, vil blodkar, bindevæv, brusk etc., påvirker trykket er nødvendig for udstansning og opsamling separate kerner. Det er derfor af betydning at øve alle trin i proceduren på materiale, der ikke er af nogen værdi, før der producerer en TMA med definerede væv for de påtænkte eksperimenter. Når sektionering en række forskellige væv inden for et TMA blok sammensætning af blokken kan påvirke evnen til at opnå høj kvalitet sektioner. Certain væv, fx hud, knoglemarv, fedt, hjerne og bryst, gøre sektionering af TMA blokken vanskeligt på grund af virkningen af ​​forskelle i konsistens, der foretager hvordan sektioner strække sig ud i vandbadet, og hvordan forskellige hårdhed skæres af bladet osv. Det anbefales derfor at gruppere væv med lignende funktioner, f.eks lipidrig vævet ind i en TMA, når det er relevant. Hovedparten af ​​cancervæv er i denne forstand homogen, hvilket letter afskæring af cancer TMA&#39;erne. En alternativ sektionering fremgangsmåde til stabilisering af microarray kerner kan anvendes ved håndtering af en TMA med heterogene vævstyper. Anvendelse af en klæbende tape kan være nyttig for at undgå tab af kerner og nedfald i snit TMA. Anvendelse af klæbende tape skal anvendes med forsigtighed, da båndet kan påvirke tykkelsen af tværsnit kerner og senere også resultaterne af IHC farvning 15. I det humane protein Atlas etablere et TMA skabelon på 9x8 (ekskl. markører) kerner are anvendt. Det er vigtigt at opnå maksimale antal sektioner og holde alle væv, der er repræsenteret i hele blokken. Hvis du vil gemme reagenser og scanning tid, er 2 sektioner placeret på en glasplade giver en maksimal skabelon for 9x8. Den største opbevaringssted for protein oplysninger, Universal Protein Resource 16 omfatter ca 20,300 revideret menneskelige protein poster, hvoraf kun ca 66% har beviser på protein niveau. Også for et flertal af de gener, for hvilke der er beviser for eksistens på protein niveau, er der sparsomt eller ingen oplysninger om proteinernes funktion og distribution af udtryk. En vigtig udfordring for fremtiden er at analysere fordelingen mønster og den relative rigelighed af disse ukendte proteiner i forskellige typer af humant væv. Oplysningerne fra databaser, såsom UniProt, Ensembl, publicerede data fra PubMed kan anvendes som en guide at fastslå, om immunohistokemisk farvning mønstre ved anvendelse af antistoffer tilafdelinger ukendte proteiner repræsenterer reelle proteinprofiler for det tilsigtede mål-proteinet. Derudover er adskillige andre validering strategier for at sikre antistof funktionalitet, for eksempel antistof funktionalitet i protein arrays, Western blot, immunfluorescens, immuno-udfældning og-nedtrækningsforsøg. Måske er det vigtigste middel til validering af antistof funktionalitet er at anvende parrede antistoffer, dvs to forskellige antistoffer rejst mod forskellige, ikke-overlappende epitoper på det samme target protein, for at sammenligne assay-specifik resultat 17. På baggrund af de indsamlede oplysninger, der er antistoffer testet og titreres i henhold til IHC-standarder og erfaringer fra test og validering af over 35.000 antistoffer i det humane protein Atlas-projektet. Mere end 20% af alle gener med protein profiler, er data fra parrede antistoffer (2 eller flere antistoffer mod ikke-overlappende epitoper på det samme protein) blev anvendt til at bestemme et bedste skønmate af det tilsvarende protein ekspressionsmønster. Forbundne antistoffer giver en ultimativ strategi for validering af specifikke immunhistokemi-baserede protein ekspressionsmønstre. Denne strategi er værdifulde, fordi de mange forskellige væv i det grundlæggende screening øger risikoen for kryds-reaktivitet. Det skal også bemærkes, at visse væv er generelt mere tilbøjelige til at vise baggrundsfarvning fx makrofager, glat muskulatur, distale tubuli i nyren og hepatocytter i leveren. Yderligere spørgsmål at overveje at omfatte variationer i vævsbehandling teknikker over tid for de væv taget fra arkivmateriale, hvilket kan resultere i falsk negative eller upassende positive ICH farvede mønstre. Dette fænomen er også forekommer i stor del analyse. Både negative og positive kontroller er afgørende og bør så vidt muligt anvendes. For dybere undersøgelser, herunder funktionelle analyser, cellelinjer med tvungen udtryk og specifikke knock-down af tilsvarende stanscripts (siRNA teknologi) kan anvendes til at skabe kontroller. For at opnå optimale resultater IHC, er det vigtigt at teste og anvende antigen søgesystemer, idet formalin fiksering inducerer forskellige kemiske modifikationer f.eks tværbinding, hydrolyse af Schiff-baser maskeringsmidler antigenet 18. Som konklusion er antistof-baserede proteomik anvender TMA-teknologi og IHC en kraftig strategi til frembringelse af proteinekspressionsniveauer data i stor skala. The Human Protein Atlas projektet er blevet oprettet for at skabe et kort over humant protein udtryk i normale humane væv og kræft. Formålet med dette projekt er at præsentere et første udkast til en omfattende human protein Atlas i 2015. Ud over at give protein profiler i normale organer og væv, også denne indsats er et godt udgangspunkt for biomedicinske forskningsprojekter, herunder kliniske biomarkør opdagelse indsats. Det ultimative mål er at tilføje et næste oplysninger lag oven på det menneskelige genom sekvens, at wivil være afgørende for en dybere forståelse af biologi som ligger bag forskellige sygdomstilstande, og skabe grundlag for udvikling af nye diagnostiske og terapeutiske redskaber.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> Vaskebuffer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Citratbuffer pH6 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Antibody Diluent </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP HRP-polymer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB plus substrat-system </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V Block </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> Primært antistof Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers hæmatoxylin </td><td> Histolab </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> Pertex </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Navn udstyr </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> Manuel væv mikro arrayer </td><td> Estigen, Beecher Instrument </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> Vandfald mikrotom </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> MicroM HM 355S </td></tr><tr><td> Automatiseret billedskanneren </td><td> Aperio Technologies </td><td> XT </td></tr><tr><td> Automatiseret slide farvningssystem </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> Automatiseret objektglas farvning for deparafinization og dehydrering </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Automatiseret glas coverslipper </td><td> Leica Biosystems </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Decloaking kammer </td><td> Biocare Medicinsk </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

Vævet mikroarray (TMA) teknologi giver mulighed for high-throughput-analyse af multiple væv og celler. Teknikken anvendes inden for human protein Atlas projekt til global analyse af protein ekspressionsmønstre i normale humane væv, cancer og cellelinier. Her præsenterer vi montering af 1 mm kerner, hentet fra mikroskopisk udvalgte repræsentative væv, til en enkelt modtager TMA blok. Antallet og størrelsen af ​​kernerne i en TMA blok kan varieres fra cirka 40 2 mm kerner til hundreder af 0,6 mm kerner. Fordelen ved at anvende TMA teknologi er, at store mængder af data kan hurtigt opnås under anvendelse af en enkelt immunfarvning protokol for at undgå eksperimentel variabilitet. Vigtigere er kun begrænset mængde af den begrænsede væv nødvendig, hvilket giver mulighed for analyse af store patientkohorter en 2. Cirka 250 konsekutive sektioner (4 um tykke) kan skæres fra en TMA blok og anvendt til immunohistokemisk staining at bestemme specifikke protein ekspressionsmønstre til 250 forskellige antistoffer. I det humane protein Atlas projektet, antistoffer frembragt mod alle humane proteiner og anvendes til at opnå tilsvarende proteinprofiler i både normale humane væv fra 144 individer og cancer væv fra 216 forskellige patienter, der repræsenterer de 20 mest almindelige former for human cancer. Immunhistokemisk farvede TMA afsnittene om objektglas bliver scannet for at skabe billeder med høj opløsning, hvorfra patologer kan fortolke og anmærke resultatet af immunhistokemi. Billeder sammen med tilsvarende patologi-baserede annotation data stilles offentligt til rådighed for forskning samfund gennem det humane protein Atlas portal ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (Figur 1) 3 4. Det humane protein Atlas tilvejebringer et kort, der viser fordelingen og den relative forekomst af proteiner i den menneskelige krop. Den aktuelle verning indeholder mere end 11 millioner billeder med proteinekspressionsniveauer data for 12.238 specifikke proteiner, som svarer til mere end 61% af alle proteiner kodet af det humane genom.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Væv microarrays muliggør en effektiv metode til at opnå samtidig information fra en lang række væv. Repræsentative dele af væv samles i en enkelt paraffin blok. Sektioner fra blokken anvendes til immunohistokemi og analyse af protein ekspressionsmønstre. Digital scanning genererer tilsvarende billeder til distribution af data.

Produktion af Tissue microarrays, Immunhistokemi farvning og digitalisering i den menneskelige protein Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Fremstilling og anvendelse af mikromiljø microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondering High-density funktionelt protein Microarrays at Detect protein-protein interaktioner

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering af 3D hvidt fedtvæv struktur ved hjælp af hele-mount farvning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

CryoAPEX-metoden til elektronmikroskopianalyse af membranproteinlokalisering i ultrastrukturelt bevarede celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...