Name: production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas
Uploaded: 2012-05-31T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Knut og Alice Wallenberg Foundation. Hele staber av Human Protein Atlas sentre i Uppsala, Stockholm og India er anerkjent for sin innsats for å generere Human Protein Atlas. Forfatterne ønsker å spesielt takke Frank Hammar og Sofie Gustafsson for hjelp med bilder og Elene Karlberg for hjelp med TMA produksjonen når filming.

1. Hvordan forberede Vev for Tissue Microarray Production (Animasjon 1) <ol><li> Velg relevant formalinfiksert parafin innebygd materiale (vev eller celleprøver) inkl. tilhørende hematoxylin beiset vev delen. </li><li> Marker relevant område på vev delen. Det anbefales å ha en nyklipt hematoxylin beiset seksjonen tilsvarende parafin blokken. </li><li> Design malen brukes for TMA produksjon. Randomize prøvene i malen for å unngå artefakter som skyldes tekniske problemer, for eksempel dekning av antistoff over hele TMA seksjonen og snitting problemer. Legg til flere orientering markører til mal for orientering. </li><li> Organiser vevet i henhold til malen. </li></ol> 2. Manuell Tissue Microarray Production (Essential for filming) <ol><li> For å kunne oppnå en standardisert lengde av vevet kjerner, merk Stylet f.eks 4,5 mm (figur 2). GuidelInes for avstand mellom prøven sentrene: kjerne størrelse 0,6 mm - 0,8 til 1,0 mm kjerne størrelse 1,0 mm - 1,8 til 2,0 mm kjerne størrelse 1,5 mm - 2,0 til 3,0 mm kjerne størrelse 2,0 mm - 2,5 til 4,0 mm Det anbefales å la 2,5-3,0 mm marginer på hver side av parafin blokken for å unngå sprekkdannelser i parafin. </li><li><ol class="lalpha"><li> Monter de valgte slag som skal brukes. Start med å løsne sekskantsokkel skruene som holder slag på plass. Punch er riktig plassert når sporet i punsj navet sitter godt plassert mot metall stang i plast v-blokk. Fest skruene og sørge for at kanten av metall klippet er horisontal. </li><li> Mottakeren slag (merket med grønt og rødt, spesifikk for distributør) bør plasseres til venstre. Den donor slag (merket i grønt og blått, spesifikk for distributør), som har en litt større diameter, bør plasseres til høyre (figur 3). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Flytt slag langs x-og y-aksene ved å bruke XY justeringsknottene. Retten ratt flytter slag langs x-aksen og venstre reguleringsknappen flytter slag langs y-aksen. Det er en digital mikrometer avlesning på begge justeringsknapper. Disse aktiveres når du flytter knottene. </li><li> Tilbakestill → trykk på ZERO / ABS-knappen. Skift mellom inches og mm → trykk på IN / mm knappen. Avstanden mellom hullene skal være 2,0 mm (målt mellom sentre av hullene) når du bruker en 1 mm slag for en 9x8 mal. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> For å sikre at du ikke skyver slag for langt ned i blokken, traff kassett og ødelegge punsj, sette en kassett uten parafin i holderen og sett bunnen plasseringen av mottakeren punsj til 1 mm over bunnen av kassetten ved hjelp av dybdeanslaget skruen påøvre venstre hjørne av Z-guide (figur 3). </li><li> Sett mottakeren blokken i holderen og bruke den minste skrutrekkeren å feste skruene. Ikke stram skruene for å stramme eller parafin kan bryte løs fra kassetten. </li><li> Skyv mottakeren punsj nedover ca 5 mm inn mottakers blokk og bruke håndtaket i slag til å rotere punsj frem og tilbake en gang (figur 3). Hullet skal være 5 mm dype når skyve slag så langt ned i blokken som mulig. </li><li> Avlaste nedover skyve presset sakte, slik at fjærene kan flytte punsj opp. Bruk Stylet å tømme punsj og kast parafin kjernen. </li></ol></li><li> Flytt turret å bytte til donor punsj (figur 3). </li><li> Plasser donor blokk brua med donor blokk over mottakeren blokken holderen (figur 3). </li><li><ol class="lalpha"><li> Skyv donor Punchh inn det valgte området av donor blokk. Bruk en tilsvarende hematoxylin og eosin fargede lysbilde hvor regionen av interesse har blitt merket å finne vev som skal tas prøver. Manuelt hold donor blokk i posisjon med venstre hånd og skyv slag med høyre hånd. Merk at du ikke skal presse på Stylet. Dybden stopp blokkerer ikke punch bevegelse i riktig posisjon for donor blokk, så det er viktig at du slutter å skyve når andre merket er synlig på Stylet. </li><li> Roter håndtaket på punsj en gang (figur 3). Sakte slipper nedover trykket mens du fremdeles holder donor blokk på donor blokk broen. </li><li> Den donor vev er fortrinnsvis hulles 0,5 mm kortere enn mottakeren kjerne. Denne prosessen vil sikre en justerbar justering av kjernene på mottakerens blokken overflaten, unngå tap av verdifull representant vev. </li></ol></li><li> Ta brua og donor blokk. Lagsikker på at donor punsj er på linje med hullet som ble laget tidligere (punkt 4). Du må justere punsj posisjon ved hjelp av festeskruene dersom donor punsj og hullet i mottakeren blokken ikke er justert. </li><li> Skyv punsj nedover til spissen når toppen av hullet i mottakeren blokken. Mens du holder denne posisjonen, bruke Stylet å tømme vevet kjernen i hullet. Kjernen Underlaget skal være i tråd med blokk overflaten. </li><li> Flytt tårnet tilbake til mottakeren punch. </li><li> Flytte til neste posisjon med XY justeringsknottene. </li><li> Gjenta fra punkt 4c over inntil matrisen er fullført. </li><li> Når hele mottaker blokken er ferdig, løsne skruene i mottakeren blokken holderen. Stek blokken i 42 ° C i 40 minutter. Sett blokken med seksjonere området vendt ned på et glass lysbilde. Plasser glass-slide med blokk på toppen av et reagensrør holderen (eller annen passende konstruksjon) og plasser i than ovnen. Etter baking, ta testen rørholder fra ovnen og flat overflate blokken ved å forsiktig stryke glasset lysbildet. </li><li> Plasser blokken med glass-slide på en kjølende plate i 10 minutter. For å sikre representative vev hele TMA en kvalitetskontroll på hver 50 th del er utført. </li></ol> 3. Slik § TMA (Animasjon 2) <ol><li> Skjær 4 mikrometer tykke seksjoner ved hjelp av en mikrotomen med § Transfer System (HM 355S, Microm). Systemet kan brukes til alle aktuelle roterende microtomes. Systemet består av et blad transportør med integrert overføring bro, et oppvarmet vannbad og en kontrollenhet. Fra bladet avsnittene glir i den våte overføringen overflaten via en overføring bro i vannbad. </li><li> Avsnittene bør tas fra vannbadet umiddelbart etter at de har strukket ut, for å unngå smelting av sensitive vev flekker (eg. lipid rike vev som bryst og hjernen). PlaCE avsnittet om en superfrost glass lysbilde. Tiden delene kan bli stående i vann avhenger av hvilken type parafin vokses brukt og vanntemperaturen. Vår lab bruk parafinvoks fra HistoLab Products AB, som har et smeltepunkt på 56-58 ° C, og vi anbefaler et vannbad temperatur på 37-39 ° C. </li><li> Plasser lysbildene i en lysbildeholderen for tørking i romtemperatur (RT) over natten. </li><li> Lysbildene er bakt i 50 ° C for 12-24 timer. Ved hjelp av en microtom uten STS du har å transportere delen fra bladet til et vannbad manuelt ved hjelp av f.eks en børste. </li></ol> 4. Test og Titrering Prosedyre for Immunhistokjemi (Animasjon 3) Hvert antistoff er utsatt for en standardisert test prosedyren med spesialdesignede TMA inneholder en blanding av vev og ulike celletyper. Målet er å vurdere en individuell og optimalisert farging protokoll for hvert antistoff. I utgangspunktet en fortynning, basert på mauribody lager konsentrasjon av den primære antistoffet er testet. Utfallet av denne testen farging brukes til å veilede videre fortynninger og optimalisering av protokollen. <ol><li> Deparaffinization og hydrering i xylen og gradert etanol til destillert vann er utført før farging. </li><li> En blokkering skritt å slukke endogene peroksidase er utført i 0,3% H 2 O 2 i 95% etanol i 5 minutter. </li><li> Heat Induced epitop Retrieval (Hier) utføres i et gjenfinningssystem buffer pH 6, ved hjelp av et trykk kjele (Decloaking kammer, Biocare Medical) som varmekilde i 4 minutter ved 125 ° C. Etter avsluttet koking, lysbilder forbli i trykket kjele og får lov til å avkjøles til 90 ° C. Den totale behandlingstiden for Hier er ca 45 minutter. </li><li> Hvis ingen konkluderende resultat oppnås i den første testen, er ytterligere tester gjort basert på det observerte flekker mønsteret 5 6. En pilotstudie, innen HPA high-throughput satt opp, visteat den mest nyttige antigenet henting der hier 6 pH, men andre uttaksmetodene som pre-inkubasjon med proteinase, mikrobølgeovn og kokende i buffer med høyere eller lavere pH kan selvfølgelig brukes. Ved å endre IHC tilstanden, for eksempel endring antistoff inkubasjonstider, antistoff fortynninger og Diaminobenzidine (DAB) inkubasjonstid farging mønsteret kan gi mer konkluderende resultater. </li></ol> 5. Farging Program, 480 Autostainer (Thermo Fisher Scientific) Alle Inkuberinger er gjort på RT og denne protokollen kan også brukes i et manuelt oppsett med de samme reagensene. <ol><li> Skyll i vaskebuffer. </li><li> Inkubasjon med Ultra V blokk i 5 minutter. </li><li> Skyll i vaskebuffer. </li><li> Inkubasjon med primær antistoff i 30 minutter. </li><li> Skyll i vaskebuffer (x2). </li><li> Inkubasjon med merket pepperrot peroksidase-polymer i 30 minutter. </li><li> Skyll i vaskebuffer (x2). </li><li> Utvikling i DAB-løsningi 10 minutter. </li><li> Skyll i vaskebuffer (x2). </li><li> Kontrafarging i Mayers hematoxylin for 5 minutter *. Når du bruker en progressiv farging metode (f.eks Mayers hematoxylin) intensiteten avhenger tid og ingen differensiering er nødvendig. En regressiv farging metode f.eks Harris hematoxylin krever differensiering for å fjerne overflødig farge fra vev for å fremheve en struktur. </li><li> Skyll i vann fra springen *. </li><li> Skyll i litiumkarbonat vann, fortynnet 1:05 fra mettet løsning i 1 minutt *. </li><li> Skyll i vann fra springen i 5 minutter *. </li><li> Lysbildene er dehydrert i gradert etanol og lysbilder er coverslipped (Pertex, Histolab) </li></ol> Alle reagenser anvendes på et volum på 300 mL per lysbilde. * Tilrettelegging 10-14 er gjort i en histostaining instrument (Autostainer XL, Leica) og coverslipping er dessuten gjort i en coverslipper system (Automated glass coverslipper CV5030, Leica). 6. Slik skanneret lysbilde Metoden for skanning av lysbilder er avhengig av digitale skanneren blir utnyttet, definerer denne protokollen bare hvordan du skanner et lysbilde med automatisert skanning systemet Aperio XT (Aperio Technologies). I Human Protein Atlas oppsett 20x forstørrelse for vev og 40x for cellene er brukt. Automatiserte skanning kunne møte fokus problemer på grunn av heterogenitet i vevet og antall ulike vev som inngår i en TMA. <ol><li> Rengjør glasset lysbildet fra skitt, lim og se etter luftbobler mellom dekkglass og seksjonen. I tilfelle av luft bobler remount raset. </li><li> Sett raset i en rack og plassere rack i den digitale skanneren. Tiden for å skanne en TMA ved 20x forstørrelse er ca 6 minutter. En programvare fra Aperio brukes til å velge område av interesse. Fokuspunktet Utvalget er gjort automatisk i programvaren. Manuelt valg av skanningsområdet og fokuspunkter er også mulig. </li><li> Etter at imaget hsom er generert den kan brukes til evaluering og annotering av IHC farging. Bilder forbli som et resultat fil av eksperimentet, og kan bli distribuert til kolleger for diskusjoner og videre brukt til å publisere dataene. Bildene kan vises i en fritt tilgjengelig programvare fra Aperio. </li></ol> 7. Slik søker du på din favoritt Protein i Human Protein Atlas <ol><li> Bla til <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> Skriv inn navnet på din favoritt protein, Ensembl id, Uniprot tiltredelse nummer eller HGNC navn f.eks insulin. </li><li> Angi sammendraget side og bla ned til normalt vev og organ sammendrag. Oversikten viser protein uttrykk i bukspyttkjertelen. </li><li> Klikk på &quot;mer vev data&quot;. Du angir vise normalt vev der du kan se alle vev inkluderte sortert etter organ. </li><li> Klikk på bukspyttkjertelen for å vise IHC resultater for 3 antistoffer rettet mot samme protein. Hvis du vil vise en hiGH-oppløsning bilde av bukspyttkjertelen klikk på bildet. </li><li> Ytterligere informasjon om protein uttrykk i kreftvev, celler og ytterligere validering data innenfor Human Protein Atlas finner du ved å bla Human Protein Atlas nettside. </li></ol> 8. Representative Resultater Animasjon en. Hvordan forberede vev for vev microarray produksjon. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Klikk her for å vise animasjon ett</a> . Animasjon to. Slik § TMA. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Klikk her for å vise animasjon to</a> . Animasjon tre. Den immunhistokjemi teknikken er beskrevet. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Klikk her for å vise animasjon tre</a> .<img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> Figur 1. Generelle ordningen i prosessen innenfor Human Protein Atlas Uppsala. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> Figur 2. Donor Stylet merket for standardisert lengde av vev kjerner f.eks 4,5 mm. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> Figur 3. Manuell vev microarrayer. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> Figur 4. Eksempler på ulik kvalitet på produsert TMA. (A) En rett og riktig justert TMA med tilstrekkelig plass mellom radene og kolonnene samt til kanten av parafin. (B) En TMA med noen av kjernene for nær kanten resulterer i sannsynlige problemer når snitting. (C) En TMA som er bakt for too lenge resulterer i en sammenrast TMA uten riktig mal. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> Figur 5. Hematoxylin og eosin fargede TMA. (A) Et riktig kuttet seksjon med rette og justert kolonner og rader. Ved hjelp av en dårlig eller skitten bladet kan resultere i splitting (B) eller komprimerte seksjoner (C). <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> Figur 6. Titrering av antistoffer. (A) reaksjon senter celler i lymfeknuter viser en optimalt titreres antistoff som resulterer i en bestemt cytoplasmisk farging (vist i brunt) uten bakgrunn. (B) Vevet delen viser svak farging. Negativ eller svak farging er funnet når konsentrasjonen av primære antistoff er for lav eller hvis målet protein er ikke tilstede i immunostained vev. (C) Vevet delen er overstained skyldes bruk av for høy konsentrasjon av primær antistoff. Darken farge resulterer i vanskeligheter bestemmer subcellulære plasseringen skyldes smitte over, kryssreaksjon og falsk positivitet.

<ol>
	<li>Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitumor+(sausage)+tissue+block:+novel+method+for+immunohistochemical+antibody+testing.">The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing.</a> Lab Invest. 55, 244-244 (1986).</li><li>Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat. Med. 4, 844-844 (1998).</li><li>Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genecentric+Human+Protein+Atlas+for+expression+profiles+based+on+antibodies.">A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies.</a> Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).</li><li>Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+protein+atlas+for+normal+and+cancer+tissues+based+on+antibody+proteomics.">A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).</li><li>Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+tissue+fixatives+on+morphology+and+antibody-based+protein+profiling+in+tissues+and+cells.">The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).</li><li>Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+monospecific+antibodies:+a+comparison+study+with+commercial+analogs+using+immunohistochemistry+on+tissue+microarrays.">Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).</li><li>Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+tissue+profiling+as+a+tool+for+clinical+proteomics.">Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics.</a> Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).</li><li>Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Protein+Atlas+-+a+tool+for+pathology.">The Human Protein Atlas - a tool for pathology.</a> J. Pathol. 216, 387-387 (2008).</li><li>Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+expression+in+cell+microarrays:+a+tool+for+antibody-based+proteomics.">Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).</li><li>Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+for+protein+profiling+in+cell+microarrays+using+automated+image+analysis.">A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis.</a> Proteomics. 7, 2142 (2007).</li><li>Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+expression+of+the+RNA-binding+protein+RBM3+is+associated+with+an+improved+clinical+outcome+in+breast+cancer.">Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer.</a> Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).</li><li>Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB2+in+combination+with+cytokeratin+20+identifies+over+95%+of+all+colorectal+carcinomas.">SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).</li><li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+new+technology+for+amplification+of+tissue+resources.">Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources.</a> Cancer J. 7, 24 (2001).</li><li>Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape+transfer+sectioning+of+tissue+microarrays+introduces+nonspecific+immunohistochemical+staining+artifacts.">Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts.</a> Biotech. Histochem. , (2010).</li><li>UniProt. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 39, D214 (2011).</li><li>Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+knowledge-based+Human+Protein+Atlas.">Towards a knowledge-based Human Protein Atlas.</a> Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).</li><li>Leong, A. S., Leong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+in+immunohistology.">Standardization in immunohistology.</a> Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Immunhistokjemi er den klart mest brukte programmet for TMA. Kombinasjonen av IHC og TMA kan brukes i flere forskjellige innstillinger, f.eks high-throughput screening av protein expression mønstre i vev 7 8 og celler 9 10, biomarkører studier basert på vevsprøver fra store pasientgrupper årskull 11 12 og mer grunnleggende tumorbiologi studier, blant annet forskjellige fenotyper / genotyper, derivasjon scener, progresjon og metastasering 13. En fordel med å bruke TMA er at materiale fra store årskull kan analyseres på en gang, og sparer både verdifull biologisk materiale og sikre mer reproduserbare eksperimenter. Dessuten sparer bruk av TMA-teknologi på reagensbeholdere kostnader og laboratorium saksbehandlingstiden. Som en TMA bare inneholder en begrenset mengde vev, er vev heterogenitet et problem. Avhengig av hvilken type vev og spørsmål tas opp, kan flere prøver være nødvendig fra samme specimen. For tumorvev, er bruken av to til fire kjerner fra hver prøve anbefalt som det har vist seg å resultere i en høy grad av nøyaktighet i representasjon av hele vevsdelene 13 14. Avhengig vevssammensetning diameteren på slag (alt fra 0,6 mm til 2 mm) kan justeres. Vev er komplekse og består av både flere forskjellige celletyper, strukturer og ekstra-cellulær matriks. Sammensetningen av hver forskjellig vevstype som inneholder variabel mengde fett, vil blodårer, bindevev, brusk etc., påvirker trykket som trengs for punching og samle separate kjerner. Det er derfor av betydning å praktisere alle trinnene i prosedyren på materiale som ikke er av noen verdi, før produsere en TMA med definerte vev for de planlagte forsøkene. Når seksjonering en rekke forskjellige vev innenfor en TMA blokk sammensetningen av blokken kunne påvirke evnen til å tilegne seg høy kvalitet seksjoner. Certain vev, f.eks hud, benmarg, fett, hjerne og bryst, gjengi Seksjonering av TMA-blokken vanskelig på grunn av forskjeller i tekstur som påvirker hvordan seksjoner strekke ut i vannbad og hvordan ulike hardhet er kuttet av bladet etc. Det anbefales derfor å gruppere vev med tilsvarende funksjoner f.eks lipid rik vevet inn en TMA, når dette er aktuelt. Flertallet av kreft vev er i denne forstand homogen, letter som seksjonering av kreft TMA. En alternativ seksjonering metode for å stabilisere microarray kjerner kan være ansatt ved håndtering en TMA med heterogene typer vev. Bruken av en tape kan være nyttig for å unngå tap av kjerner og fall-out i seksjoneres TMA. Bruk av teip bør benyttes med forsiktighet, ettersom tapen kan påvirke tykkelsen av seksjonert kjerner og senere også utfallet av IHC farging 15. I Human Protein Atlas satt opp en TMA mal av 9x8 (unntatt markører) kjerner are brukt. Det er viktig å få maksimal antall seksjoner og holder alle vev er representert i hele blokken. For å lagre reagenser og skanning tid, er 2 seksjoner plasseres på en glass-slide gir maksimal mal av 9x8. Den store repository for protein informasjon, omfatter Universal Protein Resource 16 lag 20.300 anmeldt menneskelig protein oppføringer, hvorav bare ca 66% har bevis på protein-nivå. Også for et flertall av de gener som det er bevis for eksistens på protein-nivå, er det lite eller ingen informasjon om protein funksjon og distribusjon av uttrykk. En viktig utfordring for fremtiden er å analysere fordelingen mønster og relativ overflod av disse ukjente proteiner i ulike typer menneskelig vev. Informasjonen fra databaser som Uniprot, ENSEMBL, publiserte data fra PubMed kan brukes som en guide for å fastslå om immunhistokjemisk farging mønstre ved hjelp av antistoffer motsengeposter ukjente proteiner representerer faktiske protein profiler av den tiltenkte målet protein. I tillegg er flere andre validering strategier for å sikre antistoff funksjonalitet, for eksempel antistoff funksjonalitet i protein matriser, Western blot, immunfluorescens, immun-nedbør og trekk-ned eksperimenter. Kanskje det viktigste verktøyet for validering av antistoff funksjonalitet er å bruke sammenkoblede antistoffer, dvs. to forskjellige antistoffer reist mot egne, ikke-overlappende epitoper på samme målet protein, for å sammenligne analysen-bestemt utfall 17. Basert på samlet opplysninger, er antistoffer testet og titreres etter IHC standarder og erfaring fra testing og validere enn 35.000 antistoffer i humant protein Atlas-prosjektet. For over 20% av alle gener med protein profiler, har data fra sammenkoblede antistoffer (2 eller flere antistoffer mot ikke-overlappende epitoper på samme protein) blitt brukt for å avgjøre en best mulig anslagkompis av tilsvarende protein uttrykk mønster. Sammenkoblede antistoffer gir en ultimate strategi for validering av spesifikke immunhistokjemi-baserte protein expression mønstre. Denne strategien er verdifullt fordi det mangfold av ulike vev som inngår i den grunnleggende screening øker risikoen for kryssreaksjon. Det bør også bemerkes at visse vev er generelt mer utsatt for å vise bakgrunnen flekker f.eks makrofager, glatte muskelceller, distal tubuli i nyrene og leverceller i leveren. Ytterligere spørsmål å vurdere omfatte variasjoner i vevet behandling teknikker over tid for de vev tatt fra arkivmateriale, noe som kan resultere i falske negative eller upassende positive IHC flekker mønstre. Dette fenomenet er også påtruffet i stor seksjon analyse. Både negative og positive kontroller er viktig og bør brukes når det er mulig. For dypere studier inkludert funksjonelle analyser, cellelinjer med tvang uttrykk og spesifikk knock-down av tilsvarende transcripts (siRNA-teknologi) kan brukes til å opprette kontroller. For optimale resultater i IHC, er det viktig å teste og bruke antigen datasystemer siden formalin fiksering induserer ulike kjemiske modifikasjoner f.eks cross-linking, hydrolyse av Schiff baser som maskerer antigen 18. I konklusjonen, er antistoff-baserte proteomikk ansette TMA teknologi og IHC en kraftig strategi for å generere protein uttrykk data i stor skala. The Human Protein Atlas-prosjektet har blitt satt opp for å lage et kart over menneskelig protein uttrykk i normal menneskelig vev og kreft. Målet med dette prosjektet er å presentere et første utkast til en omfattende menneskelig protein Atlas innen 2015. I tillegg til å gi protein profiler i normale organer og vev, gir dette arbeidet også et utgangspunkt for biomedisinske forskningsprosjekter, herunder kliniske biomarkører innsats. Det ultimate målet er å legge til en neste opplysninger lag på toppen av det menneskelige genom sekvens som wivil være avgjørende for en dypere forståelse av biologi underliggende ulike sykdomstilstander, og gi et grunnlag for å utvikle nye diagnostiske og terapeutiske verktøy.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Vaskebuffer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Citratbuffer pH6 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Antistoff fortynningsmiddel </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP HRP polymer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB pluss underlaget system </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V Block </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> Primary Antibody Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers hematoxylin </td><td> Histolab </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> Pertex </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Navn på utstyr </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Manuell vev micro arrayer </td><td> Estigen, Beecher Instrument </td><td> MTA-en </td></tr><tr><td> Waterfall mikrotom </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> Automatisert image scanner </td><td> Aperio Technologies </td><td> XT </td></tr><tr><td> Automatisert lysbilde farging system </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> Automatisert lysbilde farging system for deparafinization og dehydrering </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Automatisert glass coverslipper </td><td> Leica Biosystems </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Decloaking kammer </td><td> Biocare Medical </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

Vevet microarray (TMA) teknologi som sørger for høy gjennomstrømming analyse av flere vev og celler. Teknikken brukes innen Human Protein Atlas prosjekt for global analyse av protein expression mønstre i normal menneskelig vev, kreft og cellelinjer. Her presenterer vi montering av 1 mm kjerner, hentet fra mikroskopisk utvalgte representative vev, i en enkelt mottaker TMA blokk. Antallet og størrelsen på kjernene i en TMA blokk kan varieres fra ca førti 2 mm kjerner til hundrevis av 0,6 mm kjerner. Fordelen med å bruke TMA teknologi er at store mengder data kan raskt hentes ved hjelp av en enkelt farging protokoll for å unngå eksperimentell variasjon. Viktigere er bare begrenset av knappe vev nødvendig, noe som åpner for analyse av store pasientgrupper kohorter 1 2. Rundt 250 påfølgende seksjonene (4 mikrometer tykk) kan bli kuttet fra en TMA blokk og brukes for immunhistokjemisk staining å bestemme bestemt protein expression mønstre for 250 forskjellige antistoffer. I Human Protein Atlas-prosjektet, er antistoffer genereres mot alle menneskelige proteiner og brukes til å skaffe tilsvarende protein profiler i både normal menneskelig vev fra 144 individer og kreft vev fra 216 forskjellige pasienter, som representerer de 20 vanligste former for menneskelig kreft. Immunohistochemically beiset TMA seksjoner på glassplater blir skannet for å lage bilder med høy oppløsning som patologer kan tolke og kommentere utfallet av immunhistokjemi. Bilder sammen med tilsvarende patologi-baserte merknadsverktøy data gjøres offentlig tilgjengelig for forskningsmiljøet gjennom menneskerettsloven Protein Atlas portal ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (figur 1) 3 4. The Human Protein Atlas gir et kart som viser fordeling og relativ overflod av proteiner i menneskekroppen. Den nåværende verSion inneholder over 11 millioner bilder med protein expression data for 12.238 unike proteiner, tilsvarende mer enn 61% av alle proteiner kodet av det menneskelige genom.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Tissue mikromatriser åpner for en effektiv metode for å få samtidige informasjon fra et mangfold av vev. Representative deler av vev settes sammen til ett parafin blokk. Seksjoner fra blokken brukes til immunhistokjemi og analyse av protein expression mønstre. Digital skanning genererer tilsvarende bilder for distribusjon av data.

Produksjon av Tissue mikromatriser, Immunhistokjemi flekker og digitalisering i menneskets Protein Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Fabrikasjon og bruk av mikromiljøet microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex produksjonsplattform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondering Høy tetthet funksjonelt protein Mikromatriser å oppdage Protein-protein interaksjoner

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering av 3D hvit fettvev struktur med hele-mount flekker

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

CryoAPEX-metoden for elektronmikroskopianalyse av membranproteinlokalisering innenfor ultrastrukturelt bevarte celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...