Name: production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas
Uploaded: 2012-05-31T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от Кнута и Алисы Валленберга основания. Весь штабов человеческий белок центров Атлас в Упсале, Стокгольме и Индии признали за их усилия, чтобы создать человека Атлас белка. Авторы особо поблагодарить Фрэнка Hammar и Софи Густафсон помощь с фотографиями и Елена Карлберг для помощи в производстве ТМА во время съемок.

<ol>
	<li>Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitumor+(sausage)+tissue+block:+novel+method+for+immunohistochemical+antibody+testing.">The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing.</a> Lab Invest. 55, 244-244 (1986).</li><li>Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat. Med. 4, 844-844 (1998).</li><li>Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genecentric+Human+Protein+Atlas+for+expression+profiles+based+on+antibodies.">A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies.</a> Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).</li><li>Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+protein+atlas+for+normal+and+cancer+tissues+based+on+antibody+proteomics.">A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).</li><li>Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+tissue+fixatives+on+morphology+and+antibody-based+protein+profiling+in+tissues+and+cells.">The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).</li><li>Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+monospecific+antibodies:+a+comparison+study+with+commercial+analogs+using+immunohistochemistry+on+tissue+microarrays.">Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).</li><li>Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+tissue+profiling+as+a+tool+for+clinical+proteomics.">Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics.</a> Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).</li><li>Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Protein+Atlas+-+a+tool+for+pathology.">The Human Protein Atlas - a tool for pathology.</a> J. Pathol. 216, 387-387 (2008).</li><li>Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+expression+in+cell+microarrays:+a+tool+for+antibody-based+proteomics.">Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).</li><li>Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+for+protein+profiling+in+cell+microarrays+using+automated+image+analysis.">A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis.</a> Proteomics. 7, 2142 (2007).</li><li>Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+expression+of+the+RNA-binding+protein+RBM3+is+associated+with+an+improved+clinical+outcome+in+breast+cancer.">Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer.</a> Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).</li><li>Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB2+in+combination+with+cytokeratin+20+identifies+over+95%+of+all+colorectal+carcinomas.">SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).</li><li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+new+technology+for+amplification+of+tissue+resources.">Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources.</a> Cancer J. 7, 24 (2001).</li><li>Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape+transfer+sectioning+of+tissue+microarrays+introduces+nonspecific+immunohistochemical+staining+artifacts.">Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts.</a> Biotech. Histochem. , (2010).</li><li>UniProt. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 39, D214 (2011).</li><li>Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+knowledge-based+Human+Protein+Atlas.">Towards a knowledge-based Human Protein Atlas.</a> Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).</li><li>Leong, A. S., Leong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+in+immunohistology.">Standardization in immunohistology.</a> Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

Иммуногистохимическое на сегодняшний день является наиболее часто используемых приложений для ТМА. Сочетание IHC и ТМА могут быть использованы в нескольких различных местах, например, высокопроизводительного скрининга белков экспрессии в тканях и 7 8 9 10 клеток, исследования биомаркеров открытие на основе образцов тканей большие когорты пациентов 11 12 и более фундаментальной биологии опухоли Исследования, в том числе различные фенотипы / генотипов, дифференциация стадий прогрессии и метастазированию 13. Одно из преимуществ использования ТМА является то, что материал из большой когорты могут быть проанализированы в одно время, как сохранение ценных биологических материалов и обеспечения более воспроизводимые эксперименты. Кроме того, использование технологии ТМА экономит на реагент затраты и время лабораторной обработки. В ТМА содержит только ограниченное количество ткани, ткани гетерогенность является проблемой. В зависимости от типа ткани и вопросов, подлежащих рассмотрению, несколько образцов может потребоваться от одного specimeл. Для опухолевых тканей, использование от двух до четырех ядер от каждого образца рекомендуется, как было показано, что приводит к высокой степени точности в представлении целых участков тканей 13 14. В зависимости от состава ткани диаметром ударов (от 0,6 мм до 2 мм) могут быть скорректированы. Ткани являются сложными и состоят как различные типы клеток, структур и внеклеточного матрикса. В состав каждого типа ткани, содержащей различное количество жира, кровеносных сосудов, соединительной ткани, хрящей и т.д., будут влиять на давление, необходимое для штамповки и сбора отдельных ядер. Поэтому важное значение для практики все этапы процедуры на материал, который не имеет никакой ценности, пока производство ТМА с определенным тканям для предполагаемого эксперимента. Когда срезов различных тканей в пределах одного блока ТМА состав блока может повлиять на возможность приобретения высокой разделы качества. Сеrtain ткани, например кожи, костного мозга, жира, мозга и молочной железы, оказываем секционирования блока ТМА затруднена из-за влияния различий в структуре осуществления разделы как растянуть на водяной бане и как различной твердости режется лезвием и т.д. Поэтому рекомендуется, чтобы группа ткани с аналогичными функциями, например, липидный богатые ткани в одном районе аэродрома, когда это применимо. Большинство раком ткани в этом смысле однородными, что облегчает секционирования рака ТМА. Альтернативный метод секционирования для стабилизации микрочипов ядра могут быть использованы при работе с гетерогенными ТМА типов тканей. Использование клейкой ленты может быть полезно, чтобы избежать потери ядер и выпадения в секционного ТМА. Использования клейкой ленты следует применять с осторожностью, поскольку ленты может повлиять на толщину секционного ядра, а затем и результат окрашивания IHC 15. В человеческий белок Атлас настройки шаблона ТМА из 9x8 (без маркеров) ядра арE используется. Важно, чтобы получить максимальное количество разделов и хранить все ткани представлены во всем блоке. Для экономии реагентов и время сканирования, 2 секции располагаются на одном стекле позволяет максимально шаблону 9x8. Основным хранилищем для белка информации, Universal 16 ресурсов белка включает в себя около 20,300 человек отзывы записи белков, из которых только около 66% есть доказательства, на белковом уровне. Кроме того, для большинства генов, для которых имеются данные о существовании на уровне белка, существует очень мало или нет информации о функции белков и распределения выражения. Важной задачей на будущее является анализ картины распределения и относительного обилия этих неизвестных белков в различные типы тканей человека. Информации из баз данных, таких как Uniprot, Ensembl, опубликованных данных PubMed может быть использована в качестве руководства по созданию моделей, если иммуногистохимического окрашивания с использованием антител кпалатах неизвестные белки представляют собой реальные профили белок предназначен целевого белка. Кроме того, ряд других стратегий проверки необходимы, чтобы обеспечить функциональность антител, например, антитела, функциональные белки массивы, Вестерн-блот, иммунофлюоресценции, иммуно-и осадки выпадающие экспериментов. Пожалуй, самым важным инструментом для проверки антител функциональности является использование парных антител, то есть два разных антител против отдельных, неперекрывающихся эпитопов на том же белка-мишени, сравнить анализ конкретных результатов 17. На основе собранной информации, антитела тестируются и титровать по IHC стандарты и опыт тестирования и проверки на 35,000 антител человека проект белка Atlas. Более 20% всех генов белков профилей, данные из парных антител (2 или более антител к неперекрывающихся эпитопов на тот же белок) был использован для определения лучших оценкаммат соответствующей выражению белка. Парные антитела обеспечивают конечной стратегии для проверки конкретных иммуногистохимии на основе модели экспрессии белка. Эта стратегия является ценным, потому что множество различных тканей, включенных в основной отбор увеличивает риск перекрестной реактивности. Следует также отметить, что некоторые ткани в целом более склонны, чтобы показать фон окраски, например, макрофаги, гладкие мышцы, в дистальных канальцев почек и гепатоцитов в печени. Дополнительные вопросы, которые следует рассмотреть изменения в технике обработки ткани с течением времени для тканей, взятых из архивных материалов, которые могут привести к ложным отрицательным или ненадлежащее положительное окрашивание модели IHC. Это явление встречается и в большом аналитическом разделе. Положительные и отрицательные контроля являются жизненно важными и должны быть использованы по мере возможности. Для более глубокого исследования, включая функциональный анализ, клеточные линии с принудительным выражения и конкретные нокдаун соответствующих трanscripts (миРНК технологии) могут быть использованы для создания элементов управления. Для получения оптимальных результатов в IHC, важно, чтобы проверить и использовать системы поиска антигена, так как формалин фиксации вызывает различные химические модификации, например, сшивание, гидролиз Шиффа маскировка антигена 18. В заключение, на основе антител протеомики использовании ТМА технологии и IHC является мощной стратегией для генерации данных экспрессии белка в больших масштабах. Белки человека Атлас проект был создан, чтобы создать карту человеческого выражения белка в нормальных тканях человека и рака. Целью данного проекта является презентация первого проекта всеобъемлющего человека Атлас белка к 2015 году. В дополнение к предоставлению белок профилей в нормальных органов и тканей, эти усилия также является отправной точкой для биомедицинских исследовательских проектов, в том числе клинических усилия открытие биомаркеров. Конечная цель заключается в добавлении следующего слоя информации в верхней части человеческого генома, что шбудете иметь решающее значение для более глубокого понимания биологии, лежащие в основе различных болезненных состояний, а также послужит основой для разработки новых диагностических и терапевтических средств.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Вымойте буфер </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Цитратный буфер pH6 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Антитела разбавителя </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> Ультравижин LP HRP полимеров </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB плюс подложка </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V Блок </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> Первичные антитела Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Майерс гематоксилин </td><td> HistolAB </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> Pertex </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Наименование оборудования </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Руководство ткани микро arrayer </td><td> Estigen, Бичер-инструмент </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> Водопад микротома </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> Автоматизированный сканер скачать </td><td> Aperio технологии </td><td> XT </td></tr><tr><td> Автоматизированная система окрашивания слайдов </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> Автоматизированная система окрашивания слайд deparafinization и обезвоживание </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Автоматизированная coverslipper стекла </td><td> Leica Biosystems </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Decloaking камеры </td><td> Biocare Медицинское </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

Ткани микрочипов (TMA) обеспечивает средства для высокой пропускной способности анализа нескольких тканей и клеток. Техника используется в проекте белков человека Атлас для глобального анализа экспрессии белка моделей в нормальных тканях человека, рак и клеточных линиях. Здесь мы представляем сборку ядра 1 мм, полученных из микроскопических выбраны ткани представителя, в единый блок получателя ТМА. Количество и размер ядер в блоке ТМА может варьироваться от примерно сорок 2 мм ядер сотни 0,6 мм ядер. Преимущество использования ТМА технологии является то, что большое количество данных, можно быстро получить с помощью единого протокола окрашивания, чтобы избежать экспериментальной изменчивости. Важно отметить, что только ограниченное количество дефицитного ткани необходимо, что позволяет при анализе большой когорты пациентов 1 2. Около 250 последовательных секций (4 мкм) могут быть вырезаны из блока ТМА и использованы для иммуногистохимического stainiнг, чтобы определить специфические закономерности экспрессии белка на 250 различных антител. В Человеческий проект белка Атлас, антитела образуются на всех белков человека и использованы для приобретения соответствующего профиля белка в нормальных тканях человека из 144 лиц и рак тканей из 216 разных пациентов, представляющих 20 наиболее распространенных форм рака у человека. Иммуногистохимическое окрашенных ТМА разделы на стеклах сканируются для создания изображений с высоким разрешением, из которых патологи можно интерпретировать и комментировать результаты иммуногистохимии. Изображения вместе с соответствующей патологией на основе данных аннотации сделаны публично доступны для научного сообщества через человеческий белок Атлас портал ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (рис. 1) 3 4. Белки человека Атлас содержит карты, показывающие распределение и относительное содержание белков в организме человека. В настоящее время версияСион содержит более 11 миллионов изображений экспрессии белка данных 12,238 уникальных белков, что соответствует более чем 61% всех белков, кодируемых геномом человека.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Ткань микрочипов позволяет эффективный метод, чтобы получить одновременно информацию из множества тканей. Представитель части тканей собраны в единый блок парафина. Разделы из блока используется для иммуногистохимии и анализа динамики экспрессии белка. Цифровое сканирование создает соответствующие образы для распространения данных.

Производство тканей Microarrays, иммуногистохимического окрашивания и цифровизации В правам Атлас белка

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Актина сотрудничества седиментации Пробирной; для анализа связывание белка с F-актин

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Количественная оценка γH2AX Очаги в образцах тканей

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Изготовление и использование микроокружения микрочипов (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Исследование высокой плотности белковых Функциональные Microarrays для обнаружения белок-белковых взаимодействий

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Визуализация 3D белой жировой ткани структуры, с помощью окрашивания целом гора

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Метод CryoAPEX для анализа электронной микроскопии мембранного белка в ультраструктурно-заповедных клетках

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 обогащает урожайность меланоцитов человека из тканей кожи взрослого человека

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...