Name: production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas
Uploaded: 2012-05-31T13:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från Knut och Alice Wallenbergs stiftelse. Hela stavar av Human Protein Atlas center i Uppsala, Stockholm och Indien känd för sina ansträngningar att generera Human Protein Atlas. Författarna vill speciellt tacka Frank Hammar och Sofie Gustafsson för att få hjälp med bilder och Elene Karlberg för att få hjälp med TMA produktionen när filmar.

1. Hur man förbereder Vävnader av tissue microarray produktion (Animation 1) <ol><li> Välj relevant formalinfixerade paraffininbäddade material (vävnads-eller cellprover) inklusive motsvarande hematoxylin betsad vävnadssnitt. </li><li> Markera relevanta området i vävnadssnittet. Det rekommenderas att ha en nyklippt hematoxylin färgade avsnittet motsvarande paraffin blocket. </li><li> Konstruera den templat som användes för TMA produktion. Slumpmässigt proverna i mallen för att undvika artefakter som orsakas av tekniska problem såsom täckning av antikroppen över hela TMA avsnitt och Sektioneringspunkter problem. Lägg till ytterligare orientering markörer för att mallen för orientering. </li><li> Anordna vävnaderna enligt mallen. </li></ol> 2. Manuell Tissue Microarray Production (avgörande för filmning) <ol><li> För att kunna få en standardiserad längd vävnad kärnor, markera sonden, t.ex. 4,5 mm (figur 2). Guidelines för avståndet mellan centra prov: kärnans storlek 0,6 mm - 0,8-1,0 mm kärnans storlek 1,0 mm - 1,8 till 2,0 mm kärnans storlek 1,5 mm - 2,0-3,0 mm kärnans storlek 2,0 mm - 2,5-4,0 mm Det rekommenderas att lämna 2,5-3,0 mm marginaler på varje sida av paraffin blocket för att undvika sprickbildning i paraffin. </li><li><ol class="lalpha"><li> Montera de valda stansar som skall användas. Börja med att lossa hex skruvarna som håller stansen på plats. Stansen är korrekt positionerad vid spåret i stansen navet är fast placerad mot metallstången i plasten V-block. Dra åt skruvarna och se till att kanten av metallklämman är horisontell. </li><li> Mottagaren stansen (markerat med grönt och rött, specifika för distributör) bör placeras vara till vänster. Den donatorstansen (markerat med grönt och blått, specifika för distributör), som har en något större diameter, placeras bör till höger (Figur 3). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Förflytta stansarna längs x-och y-axlarna med hjälp av XY rattarna. Höger inställningsratt förflyttar stansarna längs x-axeln och den vänstra inställningsratten förflyttar stansarna längs y-axeln. Det är en digital mikrometer avläsning på båda rattarna. Dessa aktiveras när du flyttar vreden. </li><li> Återställ → Tryck på ZERO / ABS-knappen. Växla mellan inches och mm → Tryck på IN / mm knappen. Utrymmet mellan hålen ska vara 2,0 mm (mätt mellan centrum av hålen) när du använder en 1 mm punch för en 9x8 mall. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> För att säkerställa att du inte trycker stansen för långt ner i blocket, slår kassetten och förstöra stansen, sätter en kassett som inte paraffin i hållaren och ställ den nedre läge mottagande stansen till 1 mm ovanför botten av kassetten genom användning av djupstoppet skruven vidövre vänstra hörnet av Z-guide (Figur 3). </li><li> Sätt mottagande blocket i hållaren och använd den minsta skruvmejsel för att fästa skruvarna. Dra inte skruvarna för hårt eller paraffin kan bryta loss från kassetten. </li><li> Skjuta mottagande stansen nedåt ungefär 5 mm i det mottagande blocket och använda handtaget i stansen för att rotera stansen och tillbaka en gång (figur 3). Hålet kommer att vara 5 mm djup när man trycker stansen så långt ner i blocket som möjligt. </li><li> Avlasta nedåt skjuter trycket långsamt, så att fjädrarna kan förflytta stansen uppåt. Använd nålen att tömma stansen och kasta paraffin kärnan. </li></ol></li><li> Flytta revolverhuvudet för att växla till den donerande stansen (figur 3). </li><li> Placera bryggan donatorblocket med det donerande blocket över den mottagande blockhållare (figur 3). </li><li><ol class="lalpha"><li> Tryck givaren punktligh in i den valda delen av donatorblocket. Använd en motsvarande hematoxylin och eosin färgade bilden där regionen av intresse har markerats för att lokalisera den vävnad som ska provtas. Manuellt hålla givaren blocket i läge med vänster hand och tryck stansen med höger hand. Observera att du inte ska trycka på nålen. Den djupanslag blockerar inte stansen rörelsen i rätt position för givaren blocket, så det är viktigt att du slutar trycka när den andra märket syns på nålen. </li><li> Vrid handtaget på stansen gång (Figur 3). Långsamt släpper ned trycket medan du fortfarande håller givaren blocket på donatorblocket bron. </li><li> Donatorvävnaden är företrädesvis stansade 0,5 mm kortare än den mottagande kärnan. Denna process kommer att säkerställa en justerbar anpassning av kärnorna på mottagarens blocket ytan, för att undvika förlust av värdefull representant vävnad. </li></ol></li><li> Ta bron och givaren blocket. GörSe till att donatorstansen är i linje med hålet som gjordes tidigare (punkt 4). Du måste justera stansen position med hjälp ställskruvarna om givaren stansen och hålet i det mottagande blocket inte är i linje. </li><li> Försiktigt sätta stansen nedåt tills dess spets når toppen av hålet i det mottagande blocket. Håll denna position, använd nålen att tömma vävnaden kärnan i hålet. Kärnans yta bör vara i inriktning med blockytan. </li><li> Flytta tornet tillbaka till mottagande stansen. </li><li> Flytta till nästa position med XY rattarna. </li><li> Upprepa från punkt 4c ovan tills matrisen är klar. </li><li> När hela mottagande blocket är klar, lossa skruvarna i det mottagande blocket hållaren. Baka blocket i 42 ° C under 40 minuter. Sätt blocket med snittning riktade nedåt på en glasskiva. Placera objektglaset med blocket ovanpå en provrörshållare (eller annan lämplig konstruktion) och placera i than ugn. Efter bakning avlägsna hållaren provröret från ugnen och platta ytan på blocket genom att försiktigt stryka den glasskiva. </li><li> Placera blocket med objektglaset på en kylplatta under 10 minuter. För att säkerställa representativa vävnader hela TMA en kvalitetskontroll på varje 50: e del utförs. </li></ol> 3. Hur avsnitt TMA (Animation 2) <ol><li> Klipp 4 ^ m tjocka sektioner med hjälp av en mikrotom med avsnitt Transfer System (HM 355S, mikroM). Systemet kan användas med alla aktuella roterande mikrotomer. Systemet består av en bladhållare med integrerad brygga, ett uppvärmt vattenbad och en styrenhet. Från bladet sektionerna glida på den våta ytan överföring via en överföring brygga in i vattenbadet. </li><li> Sektionerna bör tas ur vattenbadet direkt efter att de har sträckt ut, för att undvika smältning av känsliga vävnad punkter (t.ex. fettrika vävnader som bröst och hjärna). Place avsnittet om en SuperFrost glasskiva. Tiden sektionerna kan lämnas kvar i vattnet beror på typen av paraffin vaxat används och vattentemperaturen. Vårt labb använder paraffin från HistoLab Products AB, som har en smältpunkt på 56-58 ° C och vi rekommenderar en temperatur vattenbad 37-39 ° C. </li><li> Placera glasen i en hållare för torkning i rumstemperatur (RT) över natten. </li><li> Objektglasen bakas i 50 ° C under 12-24 timmar. Med hjälp av en microtom utan att STS har du att transportera sträckan bladet till ett vattenbad manuellt med hjälp av t.ex. en borste. </li></ol> 4. Test och Titrering Förfarande för immunohistokemi (Animation 3) Varje antikropp utsattes för en standardiserad testförfarande med användning av speciellt utformade TMA innehållande en blandning av vävnader och olika celltyper. Syftet är att bedöma en individ och optimerad immunfärgning protokoll för varje antikropp. Inledningsvis en utspädning baserad på ANTibody förrådskoncentration av den primära antikroppen testas. Resultatet av detta test färgning används för att styra ytterligare spädningar och optimering av protokollet. <ol><li> Deparaffinization och hydratisering i xylen och graderad etanol till destillerat vatten utförs före immunfärgning. </li><li> En blockerande steg för att släcka endogen peroxidas utförs i 0,3% H2O 2 i 95% etanol i 5 minuter. </li><li> Värmeinducerad epitopretrieval (HIER) utförs i ett återvinningssystem pH 6 med användning av en tryck panna (Decloaking kammare, Biocares medicinskt) som värmekälla under 4 minuter vid 125 ° C. Efter avslutad kokning, glider kvar i trycket panna och får svalna till 90 ° C. Den totala behandlingstiden för HIER är ca 45 minuter. </li><li> Om ingen avgörande resultat erhålls vid det inledande testet, behövs ytterligare tester görs utifrån observerade färgningsmönstret 5 6. En pilotstudie inom HPA hög genomströmning set-up, visadeatt den mest användbara antigenåtervinning där HIER pH 6, men andra metoder hämtning såsom förinkubation med proteinas, mikrovågsugn och kokande i buffert med högre eller lägre pH kan naturligtvis användas. Genom att ändra IHC tillståndet, t.ex. föränderliga tider antikroppsinkubationen, utspädningar antikroppar och diaminobensidin (DAB) inkubationstider färgningen mönstret kan ge mer övertygande resultat. </li></ol> 5. Färgning Program, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Alla inkubationer utförs vid RT och detta protokoll kan även användas i som en manuell installation med samma reagens. <ol><li> Skölj i tvättbuffert. </li><li> Inkubation med Ultra V-blocket i 5 minuter. </li><li> Skölj i tvättbuffert. </li><li> Inkubation med primär antikropp under 30 minuter. </li><li> Skölj i tvättbuffert (x2). </li><li> Inkubation med märkt pepparrotsperoxidas-polymeren i 30 minuter. </li><li> Skölj i tvättbuffert (x2). </li><li> Utvecklas i DAB-lösningunder 10 minuter. </li><li> Skölj i tvättbuffert (x2). </li><li> Motfärgning i Mayers hematoxylin för 5 minuter *. När du använder en progressiv färgning metod (t.ex. Mayers hematoxylin) intensiteten beror på tid och ingen differentiering krävs. En regressiv färgningsmetod t.ex. Harris hematoxylin kräver differentiering för att avlägsna överskott av färgämne från vävnader för att accentuera en struktur. </li><li> Skölj i kranvatten *. </li><li> Skölj i litiumkarbonat vatten, späddes 1:05 från en mättad lösning under 1 min *. </li><li> Skölj i kranvatten under 5 minuter *. </li><li> Glasen är uttorkad i graderade etanol och bilder är täckglas (PERTEX, Histolab) </li></ol> Alla reagens anbringas på en volym av 300 | il per objektglas. * Steg 10-14 utförs i en histostaining instrumentet (Autostainer XL, Leica) och täckglas är dessutom göras i en coverslipper systemet (Automated glas coverslipper CV5030, Leica). 6. Hur du skannaren bild Metoden för skanning bilder är beroende av den digitala skannern utnyttjas definierar detta protokoll bara hur att skanna en bild med hjälp av automatisk genomsökning systemet Aperio XT (Aperio Technologies). I Human Protein Atlas set-up 20x förstoring för vävnaden och 40x för cellerna används. Automatiserade scanning kan stöta fokus problem på grund av heterogenitet av vävnaden och antalet olika vävnader som ingår i ett TMA. <ol><li> Rengör glasskiva från smuts, lim och kontrollera luftbubblor mellan täckglaset och avsnittet. Vid luftbubblor remount bilden. </li><li> Sätt bilden i en rack och plats i racket i den digitala skannern. Tiden för att avsöka ett TMA vid 20 gångers förstoring är ca 6 minuter. En programvara från Aperio används för att välja intresseområde. Fokuspunkten val görs automatiskt inom programmet. Manuellt val av skanningsområdet och poäng fokus är också möjligt. </li><li> Efter bild hsom genererats kan användas för utvärdering och notering av IHC-färgning. Bilder kvarstå som en följd fil experimentet och kan distribueras till kollegor för att diskutera och sedan användas för att publicera data. Bilderna kan ses i ett fritt tillgängligt program från Aperio. </li></ol> 7. Söka på din favorit Protein i Human Protein Atlas <ol><li> Bläddra till <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> Ange namnet på din favorit protein, Ensembl id, UniProt anslutning nummer eller HGNC namn, t.ex. insulin. </li><li> Skriv sammanfattningen sidan och bläddra ner till normal vävnad och organ sammanfattning. Översikten visar proteinuttryck i bukspottkörteln. </li><li> Klicka på &quot;fler vävnad data&quot;. Du anger de normala vävnaderna vy där du kan se alla vävnader ingick sorterade efter organ. </li><li> Klicka på bukspottkörteln att visa IHC resultaten för 3 antikroppar riktade mot samma protein. För att visa en hiGH-upplösning i bukspottkörteln klicka på bilden. </li><li> Ytterligare information om protein uttryck i cancer vävnad, celler och ytterligare validering av uppgifter inom Human Protein Atlas kan hittas genom att bläddra i Human Protein Atlas hemsida. </li></ol> 8. Representativa resultat Animation 1. Hur förbereder vävnader för tissue microarray produktion. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Klicka här för att se Animation 1</a> . Animation 2. Så här avsnittet TMA. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Klicka här för att se Animation 2</a> . Animation 3. Immunohistokemi tekniken beskrivs. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Klicka här för att se Animation 3</a> .<img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> Figur 1. Övergripande syftet med processen inom Human Protein Atlas Uppsala. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> Figur 2. Givare sond märkt för standardiserad längd vävnad kärnor, t.ex. 4,5 mm. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> Figur 3. Manuell vävnad microarrayer. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> Figur 4. Exempel på olika kvalitet tillverkade TMA. (A) En rak och väl i linje TMA med tillräckligt utrymme mellan rader och kolumner samt till kanten av paraffin. (B) En TMA med några av kärnorna för nära kanten resulterar i sannolika svårigheter när snittning. (C) En TMA som har bakats för too resulterar länge i en kollapsad TMA utan rätt mall. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> Figur 5. Hematoxylin och eosin-färgade TMA. (A) En korrekt skuren sektion med raka och inriktade kolumner och rader. Användning av en dålig eller smutsig bladet skulle kunna resultera i klyvning (B) eller komprimerade delar (C). <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> Figur 6. Titrering av antikroppar. (A) reaktion centrum celler i lymfknutan visar en optimalt titrerades antikropp resulterar i en specifik cytoplasmisk färgning (visad i brun) utan bakgrund. (B) vävnadssnittet visar svag färgning. Negativ eller svaga färgning hittas när koncentrationen av primär antikropp är för låg eller om målproteinet inte är närvarande i immunofärgade vävnaderna. (C) vävnadssnittet är overstained grund av användning av alltför hög koncentration av primär antikropp. I darken färgresultat i svårigheter bestämmer subcellulära platsen på grund av att spilla över korsreaktivitet och falskt positivitet.

<ol>
	<li>Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitumor+(sausage)+tissue+block:+novel+method+for+immunohistochemical+antibody+testing.">The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing.</a> Lab Invest. 55, 244-244 (1986).</li><li>Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat. Med. 4, 844-844 (1998).</li><li>Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genecentric+Human+Protein+Atlas+for+expression+profiles+based+on+antibodies.">A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies.</a> Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).</li><li>Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+protein+atlas+for+normal+and+cancer+tissues+based+on+antibody+proteomics.">A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).</li><li>Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+tissue+fixatives+on+morphology+and+antibody-based+protein+profiling+in+tissues+and+cells.">The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).</li><li>Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+monospecific+antibodies:+a+comparison+study+with+commercial+analogs+using+immunohistochemistry+on+tissue+microarrays.">Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).</li><li>Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+tissue+profiling+as+a+tool+for+clinical+proteomics.">Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics.</a> Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).</li><li>Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Protein+Atlas+-+a+tool+for+pathology.">The Human Protein Atlas - a tool for pathology.</a> J. Pathol. 216, 387-387 (2008).</li><li>Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+expression+in+cell+microarrays:+a+tool+for+antibody-based+proteomics.">Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).</li><li>Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+for+protein+profiling+in+cell+microarrays+using+automated+image+analysis.">A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis.</a> Proteomics. 7, 2142 (2007).</li><li>Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+expression+of+the+RNA-binding+protein+RBM3+is+associated+with+an+improved+clinical+outcome+in+breast+cancer.">Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer.</a> Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).</li><li>Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB2+in+combination+with+cytokeratin+20+identifies+over+95%+of+all+colorectal+carcinomas.">SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).</li><li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+new+technology+for+amplification+of+tissue+resources.">Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources.</a> Cancer J. 7, 24 (2001).</li><li>Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape+transfer+sectioning+of+tissue+microarrays+introduces+nonspecific+immunohistochemical+staining+artifacts.">Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts.</a> Biotech. Histochem. , (2010).</li><li>UniProt. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 39, D214 (2011).</li><li>Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+knowledge-based+Human+Protein+Atlas.">Towards a knowledge-based Human Protein Atlas.</a> Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).</li><li>Leong, A. S., Leong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+in+immunohistology.">Standardization in immunohistology.</a> Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).</li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

Immunohistokemi är den i särklass vanligaste ansökan om TMA. Kombinationen av IHC, och TMA kan användas i flera olika sammanhang, t.ex. high-throughput screening av mönster proteinuttryck i vävnader 7 8 och celler 9 10, biomarkörer studier baserade på vävnadsprover från stora patientgrupper 11 12 och mer grundläggande tumör biologi studier, inklusive olika fenotyper / genotyper, scener differentiering, utveckling och metastaser 13. En fördel med användning av TMA är att material från en stor skara kan analyseras på en gång, båda spara värdefull biologisk materialet och säkerställer mer reproducerbara experiment. Dessutom sparar användningen av TMA teknik reagens kostnader och laboratoriet handläggningstiden. Som en TMA bara innehåller en begränsad mängd vävnad, är vävnad heterogenitet ett problem. Beroende på vilken typ av vävnad och frågor som skall behandlas, kan flera prover behövs från samma specimen. För tumörvävnader är användningen av två till fyra kärnor från varje prov eftersom detta har visat sig resultera i en hög grad av noggrannhet i representationen av hela vävnadssnitt 13 14. Beroende på vävnaden komposition diametern hos stansarna (från 0,6 mm till 2 mm) kan justeras. Vävnader är komplexa och består av både flera olika celltyper, strukturer och extracellulär matrix. Sammansättningen av varje annan vävnadstyp innehållande varierande mängd fett, kommer blodkärl, bindväv, brosk etc, påverkar det tryck som behövs för stansning och uppsamling separata kärnor. Det är därför viktigt att träna alla steg i proceduren på material som inte är av något värde, innan en TMA med definierade vävnader för de avsedda försöken. När sektionering en mängd olika vävnader inom en TMA kvarter sammansättningen av blocket skulle kunna påverka förmågan att förvärva hög kvalitet sektioner. Certain vävnader, t.ex. hud, benmärg, fett, hjärna och bröst, gör sektionering av TMA blocket svårt på grund av effekten av skillnader i textur som påverkar hur avsnitten sträcka ut i vattenbadet och hur olika hårdhet skärs av bladet etc. Det rekommenderas därför att gruppera vävnader med liknande egenskaper, t.ex. lipid rika vävnad i en TMA, i förekommande fall. Majoriteten av cancer vävnader är i denna mening homogena, vilket underlättar sektionering av cancer TMA. En alternativ sektionering förfarande för stabilisering av mikromatrisen kärnorna kan användas vid hantering av en TMA med heterogena typer av vävnader. Användningen av en adhesiv tejp kan vara till hjälp för att undvika förlust av kärnor och fall-out i den sektionerade TMA. Användningen av tejp bör användas med försiktighet, eftersom bandet kan påverka tjockleken på sektionerade kärnor och senare även resultatet av IHC färgning 15. I Human Protein Atlas ställa upp en TMA mall för 9x8 (exklusive markörer) kärnor are användas. Det är viktigt att få maximalt antal sektioner och hålla alla vävnader representerade hela blocket. För att spara reagenser och scanning tid är 2 sektioner placeras på en glasskiva medger en maximalt mall av 9x8. Den största databas för protein information inkluderar Universal Protein Resource 16 ungefär 20,300 omdömet mänskliga protein poster, varav endast cirka 66% har bevis på proteinnivå. Även för en majoritet av de gener för vilka det finns tecken på existens på proteinnivå finns knappt eller ingen information om proteiners funktion och distribution av uttryck. En viktig utmaning för framtiden är att analysera fördelningen mönstret och relativ förekomst av dessa okända proteiner i olika typer av mänsklig vävnad. Informationen från databaser som Uniprot, Ensembl, publicerade data från PubMed kan användas som en vägledning för att fastställa om immunhistokemiska färgningsmönster med antikroppar motavdelningar okända proteiner representerar faktiska proteinprofiler av den avsedda mål-proteinet. Dessutom är flera andra strategier för validering för att säkerställa antikropp funktionalitet, till exempel antikroppar funktionalitet i protein arrayer, Western blot, immunofluorescens, immuno-nederbörd och pull-down experiment. Kanske det viktigaste verktyget för validering av antikroppar funktioner är att använda parade antikroppar, dvs två olika antikroppar riktade mot olika, icke-överlappande epitoper på samma målprotein, att jämföra analysen specifik resultatet 17. Baserat på sammanställs information, antikroppar testas och titreras i enlighet med IHC normer och erfarenheter från testning och validering av över 35.000 antikroppar i Human Protein Atlas-projektet. För över 20% av alla gener med proteinprofiler har data från parade antikroppar i 2 eller flera antikroppar mot icke-överlappande epitoper på samma protein) använts för att bestämma en bästa uppskattmate av motsvarande protein expressionsmönster. Kopplade antikroppar ger ett ultimat strategi för att validera specifika immunohistokemi-baserade mönster protein uttryck. Denna strategi är värdefull eftersom den mångfald av olika vävnader som ingår i den grundläggande screening ökar risken för korsreaktivitet. Det bör också noteras att vissa vävnader i allmänhet mer benägna att visa bakgrundsfärgning t.ex. makrofager, glatt muskulatur, distala tubuli i njure och hepatocyter i levern. Ytterligare frågor att ta i beaktande skillnaderna i tekniker vävnadsbehandling över tiden för de vävnader som tas från arkivmaterial, vilket kan resultera i falskt negativa eller olämplig positiva IHC färgningsmönster. Detta fenomen kan också påträffas i stor del analys. Både negativa och positiva kontroller är viktigt och bör användas när det är möjligt. För djupare studier inkluderande funktionella analyser, cellinjer med tvingas uttryck och specifika knock-down för motsvarande transcripts (siRNA-teknik) kan användas för att skapa kontroller. För bästa resultat i IHC, är det viktigt att testa och använda system antigenåtervinning, eftersom formalin fixeringen inducerar olika kemiska modifieringar, t.ex. tvärbindning, hydrolys av Schiffs baser mask antigenet 18. Sammanfattningsvis är antikroppsbaserade proteomik använder TMA teknik och IHC en kraftfull strategi för att generera data som protein uttryck i stor skala. The Human Protein Atlas-projektet har inrättats för att skapa en karta över humant protein uttryck i normala humana vävnader och cancer. Syftet med detta projekt är att presentera ett första utkast till en övergripande Human Protein Atlas 2015. Förutom att ge protein profiler i normala organ och vävnader, ger detta arbete också en utgångspunkt för biomedicinska forskningsprojekt, inklusive kliniska försök biomarkörer. Det slutliga målet är att lägga en nästa information ovanpå det mänskliga genomet sekvens som wikommer att vara avgörande för en djupare förståelse av biologin bakom olika sjukdomstillstånd och ge en grund för att utveckla nya diagnostiska och terapeutiska verktyg.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Tvättbuffert </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Citrat-buffert pH 6 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Antikropp utspädningsmedel </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP HRP polymeren </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB plus substrat systemet </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V Block </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> Primär antikropp Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers hematoxylin </td><td> Histolab </td><td> 01.820 </td></tr><tr><td> PERTEX </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Namnet på den utrustning </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Manuell vävnad mikro arrayer </td><td> Estigen, Beecher instrumentet </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> Vattenfall mikrotom </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> MikroM HM 355S </td></tr><tr><td> Automatiserad bildscanner </td><td> Aperio Technologies </td><td> XT </td></tr><tr><td> Automatiserad bild färgning systemet </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> Automatiserad bild färgning för deparafinization och uttorkning </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Automatiserad glas coverslipper </td><td> Leica Biosystems </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Decloaking kammare </td><td> Biocare Medical </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

Vävnaden microarray (TMA)-teknik ger möjlighet för high-throughput analyser av flera vävnader och celler. Tekniken används inom Human Protein Atlas-projektet för global analys av mönster proteinuttryck i normala humana vävnader, cancer och cellinjer. Här presenterar vi montering av 1 mm kärnor, hämtas från mikroskopiskt utvalda representativa vävnader, till en enda mottagare TMA block. Antalet och storleken av kärnorna i en TMA-block kan varieras från ca 40 2 mm kärnor till hundratals 0,6 mm kärnor. Fördelen med att använda TMA tekniken är att stora mängder data snabbt kan erhållas med en enda immunfärgning protokoll för att undvika experimentell variation. Viktigt endast begränsad mängd knappa vävnad behövs, vilket gör det möjligt för analys av stora patientgrupper 1 2. Ca 250 på varandra följande sektioner (4 pm tjockt) kan skäras från ett TMA-block och användes för immunhistokemisk staining att fastställa specifika mönster proteiner uttryck för 250 olika antikroppar. I Human Protein Atlas-projektet är antikroppar genereras mot alla humana proteiner och används för att förvärva motsvarande protein profiler i både normala humana vävnader från 144 individer och vävnader cancer från 216 olika patienter, vilket motsvarar de 20 vanligaste formerna av cancer hos människor. Immunhistokemiskt färgade TMA avsnitt på objektglas scannas för att skapa bilder med hög upplösning som patologer kan tolka och kommentera resultatet av immunohistokemi. Bilder tillsammans med motsvarande patologi-baserade kommenteringsverktyg uppgifter görs offentligt tillgängliga för forskarsamhället genom Human Protein Atlas portal ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (Figur 1) 3 4. The Human Protein Atlas ger en karta som visar fördelningen och relativ förekomst av proteiner i människokroppen. Den nuvarande versionen innehåller mer än 11 ​​miljoner bilder med data proteinuttryck för 12.238 unika proteiner, vilket motsvarar mer än 61% av alla proteiner som kodas av det humana genomet.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Vävnad mikromatriser möjliggör en effektiv metod för att få samtidig information från en mängd vävnader. Representativa delar av vävnader sätts samman till en enda paraffinblock. Sektioner från blocket används för immunohistokemi och analys av mönster proteinuttryck. Digital skanning genererar motsvarande bilder för distribution av data.

Produktion av Tissue Microarrays, immunohistokemi Staining och digitalisering inom Human Protein Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Kvantifiering av γH2AX foci i vävnadsprover

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

Tillverkning och användning av mikromiljö microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform vid EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondering hög densitet funktionellt protein Microarrays att upptäcka protein-proteininteraktioner

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering av 3D vit fettvävnad struktur med hjälp av hela-mount färgning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

CryoAPEX-metoden för elektronmikroskopi analys av membranproteinlokalisering inom ultrastrukturellt bevarade celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Y-27632 Berikar avkastningen av mänskliga melanocyter från vuxna hudvävnader

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...