Name: methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex
Uploaded: 2012-05-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex at JoVE.com

Nous remercions le Dr Shirin Bonni pour fournir la construction pSil-GFP, M. Alper Uzun pour l&#39;illustration de la figure 1, et l&#39;installation de bio-imagerie Leduc pour la microscopie confocale. EMM est pris en charge par la bourse de carrière pour les sciences médicales de l&#39;Burroughs Wellcome Fund, un NARSAD Prix des jeunes chercheurs, et les NIH NCRR COBRE P20 RR018728-01. SBL est soutenu par le NIH NCRR P20 COBRE RR018728-01, et a reçu le soutien de PHS NRSA 5T32MH019118-20.

1. Préparation des solutions de la Culture et médias (pas dans la vidéo) <ol><li> Préparez 1 litre de solution complète saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant HBSS 1x, 2,5 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM de D-glucose, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4 et 4 mM NaHCO 3. Ajouter l&#39;eau bidistillée (FD 2 O). Stériliser par filtration avec un filtre de 0,2 um et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer le milieu de culture tranche en utilisant 35 ml de milieu de Eagle ...

<ol>
	<li>Angevine, J. B., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse.">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li><li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation,+cell+death,+and+migration+in+the+embryonic+neocortex.">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li><li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis.">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li><li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li><li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization.">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li><li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders:+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors.">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li></ol>

Ces procédés impliquant l&#39;électroporation ex vivo de plasmides codant pour l&#39;ARN double brin épingles à cheveux 8 et la culture de tranches organotypiques 4 fournissent plusieurs avantages distincts. Tout d&#39;abord, ces méthodes permettent une évaluation rapide de l&#39;ARNi dérivés phénotypes. L&#39;inclusion d&#39;une cassette d&#39;expression codant pour la GFP dans le vecteur pSilencer même qui contient le promoteur U6 qui entraîne le double brin d&#39;ARN en épi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Hamilton seringue </td><td> HAMILTON </td><td> 80008 </td><td> De calibre 31, 0,5 cm de long, PT-4 (niveau de biseautage point), le volume 10 pi </td></tr><tr><td> Tweezertrodes Platinum </td><td> BTX </td><td> 45-0489 </td><td> La taille de 5mm </td></tr><tr><td> ECM830 électroporateur </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTX Footswitch </td><td> BTX </td><td> 45-0208 </td><td> Pour une utilisation avec ECM830 électroporateur </td></tr><tr><td> Microtome à lame vibrante </td><td> LEICA </td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - plat bien à utiliser avec des inserts </td><td> FALCON </td><td> 353502 </td><td> Contient encoches pour s&#39;adapter à inserts </td></tr><tr><td> Inserts de culture de tissus </td><td> FALCON </td><td> 353090 </td><td> 0,4 micromètre </td&gt; </tr><tr><td> Fast Green </td><td> SIGMA </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td> Faible fusion Agarose </td><td> FISHER </td><td> BP165-25 </td><td> L&#39;ADN de qualité </td></tr><tr><td> La laminine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu de base d&#39;Eagle </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS 10x sans Ca et Mg </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES sans acide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex

Le cortex cérébral dirige les fonctions cognitives supérieures. Cette structure à six couches est généré dans un intérieur et unième, hors-dernière de manière, dans lequel les premiers neurones nés restent plus proches de l&#39;ventricule tandis que les neurones derniers nés migrer au-delà des premiers neurones nés vers la surface du cerveau 1. En plus de la migration neuronale 2, un processus clé pour la fonction corticale normale est la régulation de la morphogenèse neuronale 3. Alors que la morphogenèse neuronale peut être étudiée in vitro dans des cultures primaires, il ya beaucoup à apprendre de la façon dont ces processus sont régis dans les environnements de tissus. Nous décrivons les techniques pour analyser la migration neuronale et / ou la morphogenèse en tranches organotypiques du cortex cérébral 4,6. Un vecteur pSilencer modifié est utilisé, qui contient à la fois un promoteur U6 qui entraîne les ARN à double brin en épingle à cheveux et une cassette d&#39;expression qui code pour la protéine distincte GFP entraînée bya promoteur CMV 7-9. Notre approche permet de l&#39;évaluation rapide des défauts dans la croissance des neurites sur knockdown spécifique de gènes candidats et a été utilisé avec succès dans un écran pour les régulateurs de croissance des neurites 8. Parce que seul un sous-ensemble de cellules expriment les constructions RNAi, les tranches organotypiques de permettre une analyse de la mosaïque des phénotypes potentiels. En outre, parce que cette analyse se fait dans une approximation proche de l&#39;environnement in vivo, il offre un faible coût et alternative rapide à la génération d&#39;animaux transgéniques ou knock-out pour les gènes de la fonction corticale inconnue. Enfin, en comparaison avec la technologie d&#39;électroporation in vivo, le succès des anciens expériences d&#39;électroporation in vivo ne dépend pas de la chirurgie de développement des compétences et de maîtrise peut être réalisée avec un temps de formation plus courte et la compétence.

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Pour procéder à une évaluation rapide de la fonction des gènes dans le développement du cortex cérébral, nous décrivons des procédés impliquant l&#39;<em&gt; Ex vivo</emÉlectroporation&gt; de plasmides co-exprimant inhibitrice ARN (ARNi) et de la GFP dans le cortex embryonnaire murin. Ce protocole est susceptible d&#39;être l&#39;étude des divers aspects de développement neurologique tels que la neurogenèse, la migration neuronale et de la morphogenèse neuronale, y compris la croissance axonale et dendritique.

Méthodes pour l&#39;étude de la morphogenèse neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Électroporation ARNi dans embryonnaire cortex cérébral murin

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

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