Name: methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex
Uploaded: 2012-05-18T12:00:00
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हम डॉ. शिरीन Bonni pSil GFP का निर्माण, चित्रा 1 के चित्रण के लिए डा. Alper, Uzun, और confocal माइक्रोस्कोपी के लिए Leduc Bioimaging सुविधा प्रदान करने के लिए धन्यवाद. ईएमएम Burroughs Wellcome कोष, एक NARSAD युवा जांचकर्ता पुरस्कार, और NIH NCRR Cobre RR018728-01 P20 से चिकित्सा विज्ञान के लिए कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित है. SBL NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01 द्वारा समर्थित है, और एनआरएसए 5T32MH019118-20 PHS से समर्थन प्राप्त हुआ है.

1. संस्कृति समाधान और मीडिया (वीडियो में नहीं) की तैयारी <ol><li> पूरा हांक संतुलित नमक (HbSS) समाधान, 1x HbSS, 2.5 मिमी Hepes (pH7.4), 30 मिमी डी ग्लूकोज, 1 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 4 MgSO और 4 मिमी 3 NaHCO युक्त 1 लीटर तैयार. दोहरा आसुत जल (DDH <s...

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	<li>Angevine, J. B., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse.">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li><li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation,+cell+death,+and+migration+in+the+embryonic+neocortex.">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li><li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis.">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li><li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li><li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization.">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li><li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders:+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors.">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li></ol>

इन तरीकों डबल असहाय आरएनए 8 hairpins और organotypic स्लाइस 4 कई विशिष्ट लाभ प्रदान की संस्कृति कूटबन्धन plasmids के पूर्व vivo electroporation शामिल. सबसे पहले, इन तरीकों के आरएनएआई व्युत्पन्न phenotypes की एक तेजी से मूल्यांकन क?...

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक का नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियाँ </td></tr><tr><td> हैमिल्टन सिरिंज </td><td> हैमिल्टन </td><td> 80,008 </td><td> 31 गेज, 0.5 इंच लंबा, PT-4 (बिंदु beveling के स्तर), 10μl मात्रा </td></tr><tr><td> प्लेटिनम tweezertrodes </td><td> BTX </td><td> 45-0489 </td><td> 5mm आकार </td></tr><tr><td> ECM830 electroporator </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTX Footswitch </td><td> BTX </td><td> 45-0208 </td><td> ECM830 electroporator के साथ प्रयोग के लिए </td></tr><tr><td> ब्लेड सूक्ष्म हिल </td><td> LEICA </td><td> VT1000 एस </td><td></td></tr><tr><td> 6 - अच्छी तरह से करने के लिए आवेषण के साथ उपयोग पकवान </td><td> फाल्कन </td><td> 353,502 </td><td> Notches के शामिल हैं आवेषण फिट </td></tr><tr><td> टिशू कल्चर आवेषण </td><td> फाल्कन </td><td> 353,090 </td><td> 0.4 सुक्ष्ममापी </p&gt; </tr><tr><td> फास्ट ग्रीन </td><td> सिग्मा </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td> कम पिघलने agarose </td><td> FISHER </td><td> BP165 - 25 </td><td> डीएनए ग्रेड </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> पाली एल Lysine </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td> बेसल मध्यम ईगल </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> बी 1522 </td><td></td></tr><tr><td> सीए और मिलीग्राम बिना 10x HbSS </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES - मुक्त एसिड </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex

प्रमस्तिष्क प्रांतस्था उच्च संज्ञानात्मक कार्यों का निर्देशन. यह छह स्तरित संरचना एक के अंदर पहले, बाहर पिछले तरीके, जिसमें पहले जन्म न्यूरॉन्स निलय के करीब रहते हुए पिछले जन्म न्यूरॉन्स 1 मस्तिष्क की सतह की दिशा में पहला जन्म न्यूरॉन्स अतीत की ओर पलायन में उत्पन्न होता है. Neuronal 2 प्रवास के अलावा, सामान्य cortical समारोह के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया neuronal 3 morphogenesis के विनियमन है. जबकि neuronal morphogenesis प्राथमिक संस्कृतियों में इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है, वहाँ कैसे इन प्रक्रियाओं ऊतक वातावरण में विनियमित रहे हैं से सीखा जा के लिए बहुत कुछ है. हम तकनीक का वर्णन neuronal प्रवास और / या के मस्तिष्क प्रांतस्था 4,6 organotypic स्लाइस में morphogenesis का विश्लेषण. एक pSilencer संशोधित वेक्टर प्रयोग किया जाता है जो दोनों एक U6 प्रमोटर है कि डबल असहाय बाल के लिये कांटा शाही सेना ड्राइव और एक अलग अभिव्यक्ति कैसेट कि GFP प्रोटीन encodes ख संचालित होता हैया सीएमवी 7-9 प्रमोटर. हमारा दृष्टिकोण उम्मीदवार जीनों की विशिष्ट पछाड़ना पर neurite परिणाम में दोषों के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है और सफलतापूर्वक neurite 8 परिणाम के नियामकों के लिए एक स्क्रीन में इस्तेमाल किया गया है. क्योंकि केवल कोशिकाओं के एक सबसेट आरएनएआई constructs व्यक्त करेंगे, organotypic स्लाइस संभावित phenotypes की एक मोज़ेक विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, क्योंकि यह विश्लेषण vivo वातावरण में एक के पास सन्निकटन में किया जाता है, यह एक कम लागत प्रदान करता है और अज्ञात cortical समारोह के जीन के लिए ट्रांसजेनिक या पीटा जानवरों की पीढ़ी के लिए तेजी से वैकल्पिक है. अंत में, vivo electroporation प्रौद्योगिकी के साथ तुलना में, पूर्व vivo electroporation प्रयोगों की सफलता कुशल सर्जरी कौशल विकास पर निर्भर नहीं है और एक छोटा प्रशिक्षण समय और कौशल के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है.

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

प्रमस्तिष्क प्रांतस्था के विकास में जीन के समारोह की एक तेजी से मूल्यांकन आचरण करने के लिए, हम शामिल विधियों का वर्णन<em&gt; पूर्व vivo</emPlasmids के electroporation निरोधात्मक शाही सेना (आरएनएआई) और murine भ्रूण प्रांतस्था में GFP सह व्यक्त. यह प्रोटोकॉल neurogenesis, neuronal प्रवास और dendrite और अक्षतंतु परिणाम सहित neuronal morphogenesis के रूप में सक्षम के चिकित्सकों के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी है.

Neuronal morphogenesis के अध्ययन के लिए तरीके:<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; भ्रूण murine प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में आरएनएआई electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

माउस रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के द्वारा अभिकर्मक Vivo में Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

विकास माउस रेटिना के vivo electroporation में

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

माउस प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में Microregional Hypoxia की अंतर्जात NADH प्रतिदीप्ति की दो photon इमेजिंग द्वारा जांच

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

और माउस मस्तिष्क प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस का उपयोग में Dendrites और कांटा के आनुवंशिक हेरफेर विज़ुअलाइज़ेशन<em&gt; Utero में</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

युगपत Electroencephalography, लैक्टेट एकाग्रता और neuronal गतिविधि के Optogenetic हेरफेर के कृंतक प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में वास्तविक समय मापन

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

तीव्र hippocampal स्लाइस में Synaptically पैदा Astroglial और neuronal प्रतिक्रियाएँ की दोहरी electrophysiological रिकॉर्डिंग

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

उच्च क्षेत्र fMRI का उपयोग वयस्क बिल्लियों में श्रवण प्रांतस्था के कार्यात्मक इमेजिंग

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

विकासशील माउस भ्रूण प्रांतस्था में सूत्रीविभाजन के रहते इमेजिंग

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

गर्भाशय में Electroporation Neuronal उप-जनसंख्या के excitability और एकल कोशिका कनेक्टिविटी अध्ययन के लिए दृष्टिकोण

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

उत्प्रेरण Cre-लोक्स reयुग्म में माउस सेरेब्रल प्रांतस्था के माध्यम से Utero में Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...