Name: methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex
Uploaded: 2012-05-18T12:00:00
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我々はpSil-GFPコンストラクト、 図1の説明のために博士アルパーウズン、共焦点顕微鏡のためのルダックバイオイメージング機能を提供するための博士シリンBonniに感謝します。 EMMは、バロウズ·ウェルカム財団、NARSAD若手研究者賞、およびNIH NCRR COBRE P20 RR018728-01から医学のためのキャリア賞でサポートされています。 SBLは、NIH NCRR COBRE P20 RR018728-01でサポートされており、PHS NRSA 5T32MH019118-20からの支援を受けています。

1。 （ないビデオで）培養液とメディアの準備<ol><li> 1X HBSS、2.5 mMのHepes緩衝液（pH7.4）、30mMのD-グルコース、1mMのCaCl 2、1mMのMgSO 4をおよび4mM NaHCO 3を含む完全ハンクス平衡塩溶液（HBSS）の1リットルを準備します。蒸留水（DDH 2 O）を追加します。 4で0.2μmフィルターや店舗℃で滅菌するフィルタリング</li><li>基礎培地イーグル培地の35mLの、完全なHBSSの12.9 mLを...

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	<li>Angevine, J. B., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse.">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li><li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation,+cell+death,+and+migration+in+the+embryonic+neocortex.">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li><li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis.">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li><li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li><li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization.">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li><li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders:+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors.">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li></ol>

器官のスライスの二本鎖RNAヘアピン8と文化をコードするプラスミド4のex vivoでのエレクトロポレーションを含むこれらのメソッドは、いくつかの明確な利点を提供しています。最初に、これらのメソッドは、RNAiから派生した表現型の迅速な評価を可能にします。二本鎖RNAのヘアピンを駆動するU6プロモーターを含む同じpSilencerベクター中の発現カセットのエンコーディ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ</td><td> HAMILTON </td><td> 80008 </td><td> 31ゲージ、長さ0.5インチ、PT-4（ポイントベベルのレベル）、10μlの体積</td></tr><tr><td>プラチナtweezertrodes </td><td> BTX </td><td> 45から0489 </td><td> 5ミリメートルサイズ</td></tr><tr><td> ECM830エレクトロ</td><td> BTX </td><td> 45から0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTXフットスイッチ</td><td> BTX </td><td> 45から0208 </td><td> ECM830エレクトロで使用するために</td></tr><tr><td>振動刃ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - インサートで使用するだけでなく料理</td><td> FALCON </td><td> 353502 </td><td>インサートに適合するようにノッチが含まれています</td></tr><tr><td>組織培養インサート</td><td> FALCON </td><td> 353090 </td><td> 0.4マイクロメートル</TD&gt; </tr><tr><td>速いグリーン</td><td> SIGMA </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td> FISHER </td><td> BP165-25 </td><td> DNAグレード</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td>ポリエルリジン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td>基礎培地イーグル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> CaとMgせずに10倍のHBSS </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-遊離酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex

大脳皮質は、より高い認知機能を指示します。この6層構造は、最後に生まれたニューロンは脳1の表面に向かって最初の生まれのニューロンを越えて移行する際、最初の生まれたニューロンは脳室に近いままでいる内に、最初に、外から最後の方法で生成されます。ニューロン移動2に加えて、正常な皮質機能のキープロセスでは、ニューロンの形態3の規制です。神経細胞の形態形成は初代培養の in vitro で検討することができますが、これらのプロセスは、組織の環境では規制されている方法から学ぶべき多くがあります。 我々は大脳皮質4,6の器官スライスの神経細胞移動および/ ​​または形態を分析する手法について説明します。 pSilencer変更されたベクトルは、二本鎖ヘアピンRNAを駆動するU6プロモーターとbを駆動するGFP蛋白質をコードする別の発現カセットの両方が含まれている使用されている屋CMVプロモーター7-9我々のアプローチは、候補遺伝子の特定のノックダウンによって神経突起伸長の欠陥を迅速に評価することができ、正常に神経突起伸長の8レギュレータの画面で使用されています。細胞のサブセットのみがRNAiコンストラクトを表現されるため、器官のスライスは、潜在的な表現型のモザイク解析を可能にします。この分析は、 生体内環境に近い近似値で行われるため、また、それは未知の皮質機能の遺伝子のための低コストおよびトランスジェニックやノックアウト動物の世代への迅速な代替手段を提供します。最後に、in vivoでのエレクトロポレーション技術と比較して、ex vivoでのエレクトロポレーション実験の成功は、熟練した外科手術のスキル開発に依存しないで、短いトレーニング時間とスキルで行うことができます。

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

大脳皮質の発達における遺伝子の機能の迅速な評価を行うために、我々は関与する方法を説明<em&gt; ex vivoで</emプラスミドをマウス胚性皮質に阻害RNA（RNAi）をとGFPを共発現の&gt;エレクトロポレーション。このプロトコルは、神経新生、神経細胞の移動と樹状突起と軸索伸長を含むニューロンの形態として、神経発達のさまざまな側面の研究に適している。

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

ハイフィールドのfMRIを使って大人の猫における聴覚皮質の機能イメージング

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...