Name: methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex
Uploaded: 2012-05-18T12:00:00
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우리는 pSil-GFP 만들어낸 그림 1의 그림에 대한 박사 Alper Uzun 및 공촛점 현미경을위한 Leduc Bioimaging 시설을 제공하는 박사 Shirin Bonni 감사드립니다. EMM은 버로우즈 Wellcome 기금, NARSAD 젊은 수사관 수상, 그리고 NIH NCRR 코브레 P20 RR018728-01에서 의학을위한 경력 수상에 의해 지원됩니다. SBL은 NIH NCRR 코브레 P20 RR018728-01에 의해 지원되며, PHS NRSA 5T32MH019118-20의 지원을 받았습니다.

1. (아니라 비디오) 문화 솔루션 및 미디어 준비하기 <ol><li> 1X HBSS, 2.5 MM Hepes (pH7.4), 30 MM D-글루코오스, 1 ㎜ CaCl 2, 1 ㎜ MgSO 4와 4 MM NaHCO 3을 포함하는 완전한 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 1 리터를 준비합니다. 이중 증류수 (ddH 2 O)를 추가합니다. 4에 0.2-μm의 필터 및 매장 ° C.로 소독을 필터링 </li><li> 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 이글 매체의 35 ML...

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	<li>Angevine, J. B., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse.">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li><li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation,+cell+death,+and+migration+in+the+embryonic+neocortex.">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li><li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis.">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li><li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li><li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization.">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li><li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders:+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors.">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li></ol>

이중 좌초된 RNA 헤어핀 8과 4는 몇 가지 뚜렷한 장점을 제공 organotypic 조각 문화 인코딩 plasmids의 전직 생체내의 electroporation을 포함한 이러한 방법. 첫째, 이러한 방법은 RNAi 파생 phenotypes의 신속한 평가를 위해 수 있습니다. 이중 좌초된 RNA의 머리핀을 운전 U6 프로 모터를 포함하는 동일한 pSilencer 벡터의 표현 카세트 인코딩 GFP의 포함은 RNAi 벡터와 electroporated 세포의 신속한 식별 및 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 해밀턴 주사기 </td><td> 해밀턴 </td><td> 80,008 </td><td> 0.5 인치 길이 31 게이지, PT-4 (포인트 beveling 수준), 10μl 부피 </td></tr><tr><td> 플래티넘 tweezertrodes </td><td> BTX </td><td> 45-0489 </td><td> 5mm 크기 </td></tr><tr><td> ECM830 electroporator </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTX Footswitch </td><td> BTX </td><td> 45-0208 </td><td> ECM830 electroporator 함께 사용하기위한 </td></tr><tr><td> 블레이드 마이크로톰 진동 </td><td> LEICA </td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 삽입과 함께 사용하기 위해 잘 요​​리 </td><td> 매 </td><td> 353,502 </td><td> 삽입에 맞게 노치를 포함 </td></tr><tr><td> 조직 문화에 삽입 </td><td> 매 </td><td> 353,090 </td><td> 0.4 마이크로 미터 </TD&gt; </tr><tr><td> 빠른 그린 </td><td> 시그마 </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 녹는 아가로 오스 </td><td> 어부 </td><td> BP165-25 </td><td> DNA 학년 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-L-라이신 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td> 기저 중간 이글 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘과 MG없이 10X HBSS </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES없는 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex

대뇌 피질은 고등인지 기능을 연결해줍니다. 이 여섯 계층 구조는 마지막으로 태어난 뉴런은 뇌의 1의 표면을 향해 첫 번째 태어난 뉴런 지났 마이 그 레이션하는 동안 첫 번째 태어난 뉴런은 뇌실에 가깝게 유지하는 내부 - 먼저, 외부 - 지난 방식에 생성됩니다. 의 연결을 마이 그 레이션이 이외에, 정상적인 대뇌 피질의 기능을위한 핵심 프로세스의 연결을 morphogenesis 3의 규정입니다. 의 연결을 morphogenesis는 기본 문화권의 체외에서 공부 할 수 있지만,이 프로세스가 조직 환경에서 규제하는 방식으로부터 배울 것이 많이 있습니다. 우리는 대뇌 피질 4,6의 organotypic 조각에의 연결을 마이 그 레이션 및 / 또는 morphogenesis을 분석하는 기법을 설명합니다. pSilencer 수정된 벡터는 이중 좌초된 머리 핀의 자형으로 RNA를 몰고 U6업자와 B를 구동 GFP 단백질을 암호화 별도의 표현 카세트를 모두 포함하는 데 사용됩니다또 CMV 프로 모터 7-9. 우리의 접근법은 후보 유전자의 특정 최저시 neurite 가지 결함의 신속한 평가를 허용하고 성공적으로 neurite의 파생물 8 규제에 대한 화면에 사용되었습니다. 세포만을 집합은 RNAi 구조를 표현하므로, organotypic 조각은 잠재 phenotypes의 모자이크 분석을 위해 수 있습니다. 이 분석은 생체내 환경의 가까운 근사치에 완료되기 때문에 더구나, 그것은 미지의 대뇌 피질 기능의 유전자에 대한 낮은 비용과 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 생성에 대한 빠른 대안을 제공합니다. 마지막으로 생체내의 electroporation 기술에 비해, 전직 생체내의 electroporation 실험의 성공 여부는 능숙하게 수술 기술 개발에 의존 아니므로 짧은 훈련 시간과 기술이 함께 수행할 수 있습니다.

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

대뇌 피질의 발달에서 유전자의 기능의 신속한 평가를 실시하기 위해, 우리는 관련된 방법을 설명<em&gt; 예 생체내</emplasmids의&gt; electroporation 억제 RNA (RNAi)와 murine 배아 피질에서 GFP를 공동 표현. 이 프로토콜은 neurogenesis,의 연결을 마이 그 레이션 및 dendrite와 축삭의 파생물을 포함하여의 연결을 morphogenesis 등 neurodevelopment의 다양한 측면의 연구를 의무이다.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

하이 필드의 fMRI를 사용하여 성인 고양이의 청각 피질의 기능적 이미징

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...