Name: high-throughput detection method for influenza virus
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection Method for Influenza Virus at JoVE.com

Dette arbejde støttes delvis NIH tilskud R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, no1-HHSN26600500032C (til SM). Vi takker vores laboratorium medlemmer for diskussion og teknisk hjælp, Tina Heil for kritisk gennemgang af manuskriptet. Vi vil gerne takke David Bina, Milwaukee Health Department laboratorium for virus kultur og PCR.

<ol>
	<li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus.">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+(PR8)+Influenza+Virus.">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus.">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li><li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+(H5N1)+viruses+using+a+pyrosequencing+method.">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Directigen+flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season.">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li><li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence.">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li><li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR:+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+(FLU+OIA).">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li><li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+into+the+infrared.">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li><li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li></ol>

Vi har intet at afsløre.

Den seneste epidemi udbrud af aviær influenza i Sydøstasien og en global frygt for svineinfluenza pandemi pålægge store bekymringer for den offentlige sundhed og sikkerhed. Kritisk fokus har været dedikeret til at generere vacciner til eksisterende og nyere stammer af influenzavirus. Tilgængelighed af hurtige high-throughput teknologier til nøjagtig detektering og nøjagtige virustiter beregninger vil enormt forbedre behandlingen. De mest almindeligt anvendte teknikker anvendes til at beregne virustiter indbefatter plak dannende og influenza hæmagglutination assays. Den plakdannende analysen blev først udviklet til at estimere bakteriofagvektorer titre og blev vedtaget af Renato Dulbecco til at beregne dyr virustitere 4. At udføre denne assay, bliver 10-folds fortyndinger af influenza bestand eller animalske prøver såsom BAL fluid forberedt og 0,1 ml alikvoter podes på den monolag af MDCK celler i 6-brønds plader. Viruset får lov til at adsorbere på de MDCK-celler efterfulgt af annoncendition af et næringsstof medium og agarose. Under inkubationen, frigive de oprindelige inficerede celler virusafkom, der spredes kun for de naboceller. Den cytopatogene virkning af den influenza viral infektion frembringer en cirkulær zone af inficerede celler kaldes en plaque. Hver plak er formodentlig dannet efter infektion af en enkelt celle med en enkelt virus partikel efterfulgt ved replikation af virus. Kontrast mellem de levende celler og de plaques kan forstærkes ved farvestoffer såsom krystalviolet. En væsentlig ulempe ved denne assay er mangel på reproducerbarhed-og enorme variationer inden eksperimenter. En anden assay anvendt til at bestemme influenza virale titer er den hæmagglutineringsassay. Den hemagglutinin-proteinet stede på overfladen af influenza-virusset effektivt binder til N-acetylneuraminsyre-holdige proteiner på mammale og aviær røde blodlegemer 1. Denne interaktion mellem den influenzavirus og de erytrocytterne fører til agglutination i form af en lattice. Den lEvel af agglutinering anvendes til at estimere titer af influenza virus i testprøver. Erythrocyt agglutination assay anvendes kun til at bestemme titrering af en kendt virus og kan ikke bruges til strain identifikation formål. Eftersom dette assay ikke skelnes mellem den levende og de døde vira, er det vanskeligt at opnå en nøjagtig beregning af virale titere. Aktuelle kliniske diagnoser af influenzainfektioner er baseret på serologisk prøvning, polymerase chain reaction, direkte modellen immunofluorescens og cellekultur 1,6. Den nye metode her beskrevne har også klinisk og laboratoriemæssige diagnostisk potentiale. Influenza detektion kits Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) og BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) anvendelse immunkromatografi assay til påvisning viralt antigen, såsom nukleoprotein 7. Ved hjælp af disse kits, påvisning af virus kan nås inden 15 minutter, men alle negative prøver skal være yderligere screened ved cellekulturen metoden. Forskellige undersøgelser har også rapporteret lav følsomhed af disse kits, især, da infektion var mild eller lav 8. I vores metode, konsekvent vi detektere så lavt som 100 PFU af virus. Dette antyder vores teknik er nyttig i påvisning af H1N1 virus i kliniske prøver, selv når infektionen er mild. A fluorescens-baseret metode til at påvise virale antigener er blevet rapporteret, hvor enten nasopharyngeale Aspirer enhederne blev direkte analyseret eller blev inokuleret på et monolag af modtagelige celler til virusmultiplikation-og efterfølgende analyser 9. Imidlertid er disse metoder begrænset til diagnostiske formål og er ikke egnede til virustiter beregninger. Q-PCR hjælper med at identificere tilstedeværelsen af ​​viralt RNA og ikke estimere den infektiviteten af ​​levende vira. Sammenlignet med disse analyser, vil IR farvestofbaseret analysesystem hjælpe med at afsløre og viral titer opregningen i kliniske prøver og laboratorieprøver. I tilfælde af influenza udbrud, er detkritisk for diagnosticere tusindvis af prøver i en kort tid periode. Vores metode baseret på en 384-brønds plade og IR scanner kan scanne 6-plader på et tidspunkt (&gt; 2.000 prøver), derfor der tilbyder en større fordel over for andre direkte fluorescerende metoder. Feasibility for hurtig behandling af tusindvis af kliniske prøver kan reducere test variation, længden af ​​analysen tid og omkostninger. Brugen af ​​en M2-specifikt antistof byder den fordel af at være uafhængig af stamme forskelle i H og N proteiner. Den M2--proteinet er relativt konserveret i de fleste influenzastammer inficerende mennesker. Hvis antistoffer specifikke for cirkulerende pletter kombineres med vores system man kan måle både titeren af ​​virus og identificere stammen. Imidlertid, eftersom M2 er målet for de Amantadine-lignende medikamenter, kan mutanter opstå, at kan ændre bindingsstedet for den mAb anvendt her. Dette svarer til en potentiel begrænsning for dette system i individer, der bliver behandlet med disse stoffer. Multipleassays anvendes til at optælle influenzavira titere i testprøver. Til at beregne virus titer, 50% vævskultur infektiøs dosis (TCID 50) og ægprodukter allantoismembraner fluid-baserede assays er almindeligt anvendt 1,10. Men kravene i flere dage at gøre disse metoder mindre pålidelige. Yderligere, i disse fremgangsmåder beregninger baseret på 50% ændring i antallet af plaques tilvejebringe teoretiske men ikke nøjagtig virale titreringer. Plaquedannende assays kan udføres inden for 96 timer; dog, mangel på reproducerbarhed er et stort problem i virale titer beregninger. Den foreliggende teknik her beskrevne har flere særskilte fordele. Først, det er en meget reproducerbar teknik med konsistente resultater. Sekund, virale titer beregninger er baseret på simpel kvantificering af fluorescensintensiteter, der er sammenlignes imod definerede standardkurver. Det tredje, kan to eller flere primære antistoffer blive brugt til at diagnosticere multiple serotyper i en given prøve. Også, IR dye-konjugerede antistoffer har Minimal autofluorescens og er blevet anvendt for celle billeddannelse 11. UV eller visuel stråling (300-600 nM) resulterer i høj cellulær autofluorescens på grund af tilstedeværelsen af ​​høje kvante ydende endogene fluoroforer. Disse indbefatter aromatiske aminosyrer, Lipo-pigmenter, pyridinic nukleotider (NADPH), elastin, collagen og flavin coenzymer. Dette iboende egenskab af celler gør det vanskeligt at udnytte disse kilder af stråling som prober at kvantificere ekspressionen af ​​specifikke proteiner. I modsætning, begejstre near-IR-farvestoffer og udleder mellem 670-1000 nm. Mange host cellulære molekyler og polyaromatiske hydrocarboner behøver ikke ophidse ved denne bølgelængde og på grund reduceret lysspredning, udsender ekstremt lav baggrundsfluorescens. Yderligere, er vinduet mellem baggrunden og specifik påvisning stærkt forbedret grund af en høj ekstinktion koefficient for de nær-IR fluorophorer. Fotostabilitet, overlegen signal-til-støjforhold, er yderst relevant i kvantificeringen af ​​virale titere. Brug af microfluidic kamre vil automatisere screening proces gennem robot kontrol, og kunne tillade os at teste meget smitsomme kliniske prøver med lethed. Således, udnyttelsen af ​​nær-IR farvestoffer i disse metoder er ideel og meget pålidelig at optælle virale titere i vævsprøver.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 virus </td><td></td><td></td><td> Fra Dr. Thomas M Moran </td></tr><tr><td> Ged anti-mus IRDye @ 800 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 fortynding </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR scanner </td><td> LI-COR-Biosciences </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384-brønde fladbundet plade </td><td> Nalge Nunc international </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-brønde fladbundet plade </td><td> Nalge Nunc international </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonat </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium Pyruvat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2-antistof </td><td></td><td></td><td> Fra Dr. Thomas M Moran </td></tr><tr><td> Anti-NP mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Opnået med en MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

Influenzavirus er en respiratorisk patogen der forårsager en høj grad af sygelighed og dødelighed hvert år i multiple dele af verden. Derfor, præcis diagnose af den inficerende stamme og hurtige high-throughput screening af et stort antal kliniske prøver er altafgørende at kontrollere spredningen af ​​pandemiske infektioner. Aktuelle kliniske diagnoser af influenzainfektioner er baseret på serologisk prøvning, polymerase chain reaction, direkte modellen immunofluorescens og cellekultur 1,2. Her, rapporterer vi udviklingen af ​​en hidtil ukendt diagnostisk teknik, der anvendes til at detektere live influenzavira. Vi brugt musen-adapterede humant A/PR/8/34 (PR8, H1N1)-virus 3 til teste effektiviteten af denne teknik under anvendelse MDCK-celler 4. MDCK-celler (10 4 eller 5 x 10 3 pr brønd) blev dyrket i 96 - eller 384-brøndsplader, inficeret med PR8 og virale proteiner blev påvist under anvendelse anti-M2 efterfulgt af en IR dye-konjugeret secsekundær antistof. M2 5 og hæmagglutinin 1 er to store markørproteiner som anvendes i mange forskellige diagnostiske assays. Anvender IR-dye-konjugerede sekundære antistoffer minimeret den autofluorescens forbundet med andre fluorescerende farvestoffer. Anvendelsen af ​​anti-M2-antistof tillod os at benytte det antigen-specifikke fluorescens intensitet som en direkte metrisk af viral mængde. At optælle fluorescensintensitet, brugte vi LI-COR Odyssey-baseret IR scanner. Dette system bruger to kanals laser-baserede IR-registreringer til at identificere fluorophorer og adskiller dem fra baggrundsstøj. Den første kanal exciterer ved 680 nm og emitterer ved 700 nm til at hjælpe kvantificere baggrunden. Den anden kanal detekterer fluoroforer, at ophidse ved 780 nm og emitterer ved 800 nm. Scanning af PR8-inficerede MDCK celler i den IR scanneren indikerede en viral titer-afhængig lyse fluorescens. En positiv korrelation mellem fluorescensintensitet at virus titer startende fra 10 2 -10 5 PFU kunne consistently observeret. Minimal men påviselige positivitet konsekvent set med 10 2 -10 3 PFU PR8 virustitere vist høj følsomhed af de nær-IR-farvestoffer. Den signal-til-støj-forholdet blev bestemt ved at sammenligne de mock-inficerede eller isotype antistof-behandlede MDCK-celler. Hjælp af de fluorescensintensiteterne fra 96 ​​- eller 384-brøndsplade formater, vi konstrueret standard titreringskurver. I disse beregninger, er den første variable det virale titer mens den anden variabel er fluorescens intensitet. Derfor, anvendte vi den eksponentielle distributionen til generere en kurve-fit at bestemme polynomium forholdet mellem de virale titere og fluorescens intensiteter. Kollektivt, vi konkludere, at IR farvestofbaseret-baseret protein detektering system kan hjælpe med at diagnosticere inficere virale stammer og præcist optælle titeren af ​​de inficerende patogener.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection Method for Influenza Virus at JoVE.com

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Denne Metoden beskriver anvendelsen af ​​Infrarødt farvestof baseret imaging system for detektion af H1N1 i bronchioalveolar lavage (BAL) fluid af smitteramte mus ved en høj følsomhed. Denne metodik kan udføres i en 96 - eller 384-brøndsplade, kræver &lt;10 gl volumen af ​​test materiale, og har potentiale for samtidig screening af multiple patogener.

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza virusformering i befrugtede hønseæg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes for influenza A-virus Detection og Isolering fra svin

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In vitro Demontering af influenza A-virus capsider ved gradientcentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Påvisning af respiratoriske patogener i Animal Prøver af Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza A Virus undersøgelser i en musemodel af infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation af undslippe varianter af neutraliserende Influenza Virus monoklonale antistoffer

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Hurtig, sikker og simpel manuel sengelamper nukleinsyre udvinding til påvisning af Virus i blodprøver

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...