Name: high-throughput detection method for influenza virus
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00
Duration: 10 min 5 s
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Diese Arbeit wird teilweise NIH Zuschüsse A1064826 R01-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (SM) unterstützt. Wir danken unseren Labor-Mitglieder zur Diskussion und technische Hilfe, Tina Heil für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir möchten David Bina, Milwaukee Health Department Virus Labor für Kultur und PCR danken.

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	<li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus.">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Kalter, S. 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Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Directigen+flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season.">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li><li>Landry, M. 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Wir haben nichts zu offenbaren.

Die jüngste Epidemie Ausbruch der Vogelgrippe in Südostasien und einer globalen Angst vor der Schweinegrippe-Pandemie zu verhängen enorme Bedenken für die öffentliche Gesundheit und Sicherheit. Kritische Schwerpunkt bei der Erzeugung von Impfstoffen für die bestehenden und neuer Stämme von Influenza-Viren gewidmet. Die Verfügbarkeit von schnellen High-Throughput-Technologien für präzise Erkennung und genaue Berechnungen Virustiter wird enorm verbessern Behandlung. Die am häufigsten verwendeten Techniken eingesetzt werden, um Virustiter zu berechnen beinhalten Plaque-bildenden und Influenza Hämagglutinationsassays. Die Plaque-bildenden-Assay wurde zunächst entwickelt, um Bakteriophagen-Titer schätzen und wurde von Renato Dulbecco angenommen zu berechnen Tier virale Titer 4. Um diesen Test durchzuführen, werden 10-fach-Verdünnungen von Influenza lizenzfreie oder tierischen Proben, wie zB BAL-Flüssigkeit hergestellt und 0,1 ml Aliquots werden auf der Monoschicht von MDCK-Zellen inokuliert in 6-Well-Platten. Das Virus wird zur Adsorption auf die MDCK-Zellen von der Ad gefolgt erlaubtdition eines Nährmediums und Agarose. Während der Inkubation, lassen Sie die Original-infizierten Zellen virale Nachkommenschaft, die nur zu den benachbarten Zellen ausbreiten. Die zytopathogene Wirkung des Influenza-Virusinfektion produziert eine kreisförmige Zone von infizierten Zellen genannt Plaque. Jede Plakette wird vermutlich nach Infektion von einer einzigen Zelle mit einem einzigen Viruspartikel von der Replikation des Virus gebildet, gefolgt. Kontrast zwischen den lebenden Zellen und die Plaques können durch Farbstoffe wie Kristallviolett verbessert werden. Ein wesentlicher Nachteil von diesem Assay ist der Mangel an Reproduzierbarkeit und eine enorme Schwankungsbreite innerhalb Experimenten. Ein weiterer Assay verwendet, um die Influenza-Virus-Titer zu bestimmen ist die Hämagglutinationsassay. Die Hämagglutinin-Protein auf der Oberfläche des Influenzavirus effizient bindet an N-Acetylneuraminsäure-enthaltenden Proteine ​​auf Säugern und Vögeln roten Blutkörperchen 1. Diese Wechselwirkung zwischen dem Influenza-Virus und den Erythrozyten führt zu Agglutination in der Form eines Gitters. Der level der Agglutination wird verwendet, um den Titer des Influenza-Virus in Prüfkörper zu schätzen. Erythrozyten-Agglutinations-Assay wird nur für die Titration von einem bekannten Virus zu bestimmen verwendet und kann nicht für Stammidentifizierungsnummer Zwecke verwendet werden. Da dieser Assay nicht zwischen dem Live-und den toten Viren zu unterscheiden, ist es schwierig, eine genaue Berechnung der viralen Titer zu erhalten. Aktuelle klinische Diagnose von Influenza-Infektionen sind auf serologische Tests, Polymerase-Kettenreaktion, direkte Probe Immunfluoreszenz und Zellkultur 1,6 basiert. Die hier beschriebene neue Verfahren hat auch klinische und labordiagnostische Potenzial. Influenza-Nachweis-Kits Directigen Flu-A (BD Biosciences, San Jose, CA) und BinaxNOW (Binax, Inc., Portland, ME) Verwendung Immunchromatographie Assay auf virales Antigen wie Nukleoprotein 7 zu erkennen. Unter Verwendung dieser Kits, Nachweis von Virus kann innerhalb von 15 min erreicht werden, doch, haben alle negativen Proben zur weiteren s betragencreened durch die Zellkultur-Verfahren. Verschiedene Studien haben auch geringe Empfindlichkeit dieser Kits, vor allem, wenn die Infektion mild oder niedrigen 8 berichtet wurde. Bei unserer Methode erkennen wir konsequent so niedrig wie 100 PFU des Virus. Dies legt nahe, unsere Technik ist hilfreich bei der Erkennung H1N1-Virus in klinischen Proben, selbst wenn die Infektion mild ist. Ein Fluoreszenz-basierte Methode zur viralen Antigene zu detektieren wurde berichtet, aus denen entweder Nasen-Rachen-Aspirat Proben direkt analysiert wurden oder wurden auf eine Monoschicht von empfänglichen Zellen zur Virusvermehrung und die anschließenden Auswertungen 9 inokuliert. Allerdings sind diese Methoden für diagnostische Zwecke beschränkt und eignen sich nicht für Virustiter Berechnungen. Q-PCR hilft, um das Vorhandensein von viraler RNA zu identifizieren und schätzt nicht die die Infektiosität von Lebend-Viren. Im Vergleich zu diesen Assays, wird IR-Farbstoff-basierten Assay-System in der Detektion und virale Titer-Enumeration in der klinischen und Laborproben zu helfen. Im Falle einer Grippewelle, ist esentscheidend für Tausende von Proben in einer kurzen Zeitperiode zu diagnostizieren. Unsere Methode auf einer 384-Well-Platte und IR-Scanner basieren, können 6-Platten in einer Zeit (&gt; 2.000 Proben) zu scannen, und bietet daher einen größeren Vorteil gegenüber anderen direkten Fluoreszenz-Methoden. Machbarkeit der schnellen Verarbeitung von Tausenden von klinischen Proben könnten reduzieren Test Variabilität, Länge der Assay-Zeit und Kosten. Die Verwendung von einem M2-spezifischen Antikörper bietet den Vorteil, dass unabhängig von Belastung Unterschiede in den H und N-Proteine. Das M2-Protein ist relativ in den meisten Influenza-Stämme infizieren Menschen konserviert. Wenn Antikörper, die spezifisch an zirkulierenden Flecken mit unserem System kombiniert werden kann man messen sowohl den Titer des Virus zu identifizieren und die Belastung. Da jedoch M2 ist das Ziel für den Amantadin-ähnliche Medikamente, können Mutanten auf, die das Bindungsstelle für den hier verwendeten mAb ändern. Dies stellt eine potentielle Beschränkung für dieses System in Individuen, die durch diese Medikamente behandelt werden. MehrereTests werden verwendet, um Influenza-Titer in Testproben aufzuzählen. Um Virustiter, 50% Gewebekultur infektiöser Dosis (TCID 50) und Eier Allantois-Flüssigkeit-basierte Assays zu berechnen sind weit verbreitet 1,10 verwendet. Stellen Sie jedoch Bedarf von mehreren Tagen diese Methoden weniger zuverlässig. Ferner wird in dieser Methoden Berechnungen auf 50% Veränderung in der Anzahl der Plaques Basis stellen theoretische, aber nicht genau viralen Titrationen. Plaque-bildenden Tests können innerhalb von 96 Stunden durchgeführt werden, jedoch ist mangelnde Reproduzierbarkeit ein wichtiges Anliegen der virale Titer Berechnungen. Die vorliegende Technik hier beschriebene Vorgehen hat mehrere deutliche Vorteile. Erstens ist es ein hoch reproduzierbare Technik mit konsistenten Ergebnissen führen. Zweitens Virustiter Berechnungen basieren auf einfachen Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten, die gegen definierte Standard-Kurven im Vergleich beruhen. Drittens kann zwei oder mehr primären Antikörper verwendet, um mehrere Serotypen in einer gegebenen Probe zu diagnostizieren. Außerdem haben IR-Farbstoff-konjugierte Antikörper minimal Autofluoreszenz und haben für Cell Imaging 11 verwendet worden. UV-oder Stoss mit niedriger Energie (300-600 nM) führt zu hohen zelluläre Autofluoreszenz aufgrund der Gegenwart von hohen Quantenausbeuten nachgebenden endogener Fluorophore. Dazu gehören aromatische Aminosäuren, Lipo-Pigmente, pyridinischer Nukleotide (NADPH), Elastin, Kollagen und Flavin-Coenzymen. Diese intrinsische Eigenschaft von Zellen macht es schwierig, diese Quellen von Strahlung zu nutzen als Sonden die Expression spezifischer Proteine ​​zu quantifizieren. Im Gegensatz dazu anregen NIR-Farbstoffe und emittieren zwischen 670-1000 nm. Viele Gastgeber zellulären Molekülen und polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe nicht bei dieser Wellenlänge anregen und aufgrund der geringeren Lichtstreuung, geben extrem geringe Hintergrundfluoreszenz. Ferner wird das Fenster zwischen dem Hintergrund und spezifischen Nachweis erheblich verbessert aufgrund einer hohen Extinktionskoeffizienten der Nah-IR-Fluorophore. Photostabilität, Hervorragendes Signal-Rausch-Verhältnis, ist äußerst relevant bei der Quantifizierung der viralen Titer. Verwendung von Microfluidic Kammern wird das Screening-Verfahren durch Roboter-Steuerungen zu automatisieren, und könnten es uns ermöglichen, hoch ansteckende klinischen Proben mit Leichtigkeit zu testen. Somit ist die Nutzung der NIR-Farbstoffe in diesen Verfahren ideale und höchst zuverlässige, um virale Titer in Gewebeproben aufzuzählen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8-Virus </td><td></td><td></td><td> Von Dr. Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Ziege anti-Maus-IRDye @ 800 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200-Verdünnung </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR-Scanner </td><td> LI-COR Biosciences- </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384-Brunnen flache Bodenplatte </td><td> Nalge Nunc internationalen </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Brunnen flache Bodenplatte </td><td> Nalge Nunc internationalen </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonat </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2-Antikörper </td><td></td><td></td><td> Von Dr. Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Anti-NP-mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Erhalten mit einem MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

Influenza-Virus ist ein Krankheitserreger, der Atemwege ein hohes Maß an Morbidität und Mortalität in jedem Jahr in verschiedenen Teilen der Welt verursacht. Daher ist eine genaue Diagnose des infizierenden Stammes und schnelle Hochdurchsatz-Screening einer großen Zahl von klinischen Proben ausschlaggebend für die Ausbreitung der Pandemie-Infektionen zu kontrollieren. Aktuelle klinische Diagnose von Influenza-Infektionen sind auf serologische Tests, Polymerase-Kettenreaktion, direkte Probe Immunfluoreszenz und Zellkultur 1,2 basiert. Hier berichten wir über die Entwicklung eines neuartigen Diagnose-Technik verwendet, um Live-Influenza-Viren zu erkennen. Wir nutzten die Maus-adaptierten menschlichen A/PR/8/34 (PR8, H1N1)-Virus 3, um die Wirksamkeit dieser Technik unter Verwendung MDCK-Zellen 4 zu testen. MDCK-Zellen (10 4 oder 5 x 10 3 pro Vertiefung) wurden in 96 kultiviert - oder 384-Well-Platten, mit PR8 und viralen Proteinen infiziert wurden unter Verwendung von anti-M2 gefolgt von einer IR-Farbstoff-konjugierten Sek.ondary antibody. M2 5 und Hämagglutinin 1 sind zwei bedeutende Marke Proteine ​​in vielen verschiedenen diagnostischen Assays verwendet. Der Einsatz IR-Farbstoff-konjugierten sekundären Antikörpern minimierte die Autofluoreszenz mit anderen fluoreszierenden Farbstoffen zugeordnet. Die Verwendung von Anti-M2-Antikörper erlaubte uns, die Antigen-spezifischen Fluoreszenzintensität als direkte Metrik von viralen Menge die verwenden. Um die Intensität der Fluoreszenz aufzählen, nutzten wir die LI-COR Odyssey IR-basierten Scanner. Dieses System verwendet zwei Kanal Laser-basierter IR-Erkennungen zu Fluorophoren identifizieren und unterscheiden sie von Hintergrundrauschen. Der erste Kanal Anregung bei 680 nm und emittiert bei 700 nm zu helfen, den Hintergrund zu quantifizieren. Der zweite Kanal erkennt Fluorophore anzuregen, dass bei 780 nm und 800 nm emittieren. Scannen von PR8-infizierten MDCK-Zellen in der IR-Scanner zeigten eine virale Titer-abhängige helle Fluoreszenz. Eine positive Korrelation der Fluoreszenzintensität zu Virustiter ab 10 2 -10 5 PFU könnte conkonsequent beobachtet. Minimal, aber nachweisbare Positivität konsequent gesehen mit 10 2 -10 3 PFU PR8 virale Titer zeigte die hohe Empfindlichkeit der Nah-IR-Farbstoffe. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis wurde durch Vergleich der Mock-infizierten oder Isotyp-Antikörper behandelten MDCK-Zellen bestimmt. Mit Hilfe der Fluoreszenz-Intensitäten von 96 - oder 384-Well-Platte-Formate, konstruierten wir Standard-Titrationskurven. In diesen Rechnungen ist die erste Variable der virale Titer, während die zweite Variable ist die Fluoreszenzintensität. Deshalb nutzten wir die exponentielle Verteilung, um eine Kurve anpassbare, um das Polynom Beziehung zwischen den viralen Titer und Fluoreszenz-Intensitäten bestimmen, zu erzeugen. Zusammen schließen wir, dass IR-Farbstoff-basierten Protein Detection System kann bei der Diagnose von viralen Stämmen infiziert und genau aufzuzählen den Titer der infizierenden Erreger.

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Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

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