Name: high-throughput detection method for influenza virus
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00
Duration: 10 min 5 s
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この作品は一部NIHの助成金R01 A1064826-01、U19 AI062627-01 NO1-HHSN26600500032C（SMに）でサポートされています。私たちは、原稿の重要なレビューのためにティナ·ハイル、議論と技術的な助けを我々の研究室のメンバーに感謝します。我々は、ウイルス培養とPCRのためにデビッド·ビナ、ミルウォーキー衛生局研究所に感謝します。

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	<li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus.">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+(PR8)+Influenza+Virus.">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus.">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li><li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+(H5N1)+viruses+using+a+pyrosequencing+method.">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Directigen+flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season.">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li><li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence.">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li><li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR:+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+(FLU+OIA).">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li><li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+into+the+infrared.">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li><li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

東南アジアにおける鳥インフルエンザと新型インフルエンザのパンデミックの世界的な恐怖の最近の流行の流行は、公衆衛生と安全に多大な懸念を課す。重要な焦点は、インフルエンザウイルスの既存および新しい株のワクチンを生成するのに専念してきました。正確な検出と正確なウイルス力価計算のための迅速なハイスループット技術の可用性は飛躍的に治療を向上させます。ウイルス力価を計算するために最もよく使用される技術は、プラーク形成、インフルエンザ赤血球凝集アッセイが含まれています。プラーク形成アッセイは、最初のバクテリオファージの力価を推定するために開発され、動物のウイルス力価4を計算するためにレナート·ダルベッコで採択された。このアッセイを実行するために、6ウェルプレートでのインフルエンザの在庫や、BAL液などの動物標本の10倍希釈液を調製し、0.1ミリリットルのアリコートを、MDCK細胞の単層に接種されています。ウイルスは、広告に続いてMDCK細胞に吸着する許可されている栄養培地及びアガロースのdition。インキュベーション中に、元の感染した細胞にのみ、隣接するセルに広がるウイルスの子孫を解放します。インフルエンザウイルス感染の細胞変性効果はプラークと呼ばれる感染細胞の円形のゾーンを生成します。各プラークは、おそらくウイルスの複製に続いて​​、単一のウイルス粒子を持つ単一の細胞の感染後に形成されています。生きている細胞とプラークの間にコントラストがそのようなクリスタルバイオレットなどの色素によって強化することができます。このアッセイの主な欠点は、再現性と実験中で巨大なバリエーションの欠如である。インフルエンザウイルスの力価を決定するために使用される別のアッセイは、赤血球凝集アッセイである。インフルエンザウイルスの表面の赤血球凝集素タンパク質が存在すると、効率的な哺乳類と鳥類の赤血球1のN-アセチルノイラミン酸含有タンパク質に結合する。インフルエンザウイルスと赤血球との間のこの相互作用は、格子状に凝集につながります。リットル凝集のevelは、試験片におけるインフルエンザウイルスの力価を推定するために使用されています。赤血球凝集アッセイは、既知のウイルスの滴定を決定するためにのみ使用され、株の同定を目的として使用することはできません。このアッセイは、ライブや死んだウイルスを区別しませんので、ウイルス力価の正確な計算を得ることが困難である。 インフルエンザ感染症の現在の臨床診断は血清学的検査、ポリメラーゼ連鎖反応、直接試料の免疫と細胞培養1,6に基づいています。ここで説明した新しいメソッドでは、臨床および実験室診断可能性を秘めています。インフルエンザ検出キットディレクインフルエンザ（BD Biosciences社、カリフォルニア州サンノゼ）とBinaxNow（Binax社、スカーバラ、ME）の使用イムノクロマトアッセイのような核タンパク質7のようなウイルス抗原を検出する。これらのキットを使用して、ウイルスの検出は、15分以内に達成することができますが、すべての負のサンプルは、さらにsとする必要があります細胞培養法によりcreened。様々な研究はまた、感染が軽度または8低く、特にこれらのキットの感度が低い、報告されています。提案手法では、我々は一貫してウイルスの100 PFUのように低い検出します。これは感染症が軽度の場合でも、私たちの技術は、臨床サンプル中のH1N1ウイルスを検出するのに有用であることを示唆している。ウイルス抗原を検出する蛍光ベースの方法のいずれか鼻咽頭吸引検体を直接分析したか、ウイルスの増殖とその後の分析の9の感受性細胞の単層に接種したところ、報告されています。しかし、これらの方法は、診断目的のために限られており、ウイルス力価の計算には適していませんされています。 Q-PCRは、ウイルスRNAの存在を識別するのに役立ち、ライブウイルスの感染性を推定することはありません。これらのアッセイに比べて、IR染料ベースのアッセイシステムは、臨床検査試料中に検出し、ウイルス力価の列挙に役立ちます。インフルエンザの流行の場合には、それは、短い期間で数千のサンプルを診断することが重要。 384ウェルプレートおよびIRスキャナに基づいて、提案手法では、したがって、他の直接蛍光法に比べて大きな利点を提供し、時間（&gt; 2000サンプル）で6プレートをスキャンすることができます。臨床サンプルの数千人の迅速な処理の実現可能性は、アッセイ時間とコストの長さを試験のばらつきを減らすことができます。 M2-特異的抗体の使用は、HとN蛋白質の系統差に依存しないという利点を提供しています。 M2蛋白質は、比較的人間に感染するほとんどのインフルエンザ株に保存されている。循環汚れに特異的な抗体は、我々のシステムと組み合わされた場合は、1つは、ウイルスの両方の力価を測定し、ひずみを識別することができます。 M2はアマンタジンのような薬物のターゲットであるため、しかし、変異体は、ここで使用されるモノクローナル抗体の結合部位を変更するかもしれない発生する可能性があります。これは、これらの薬剤によって治療されている個人で、このシステムの潜在的な制限を表しています。 複数アッセイは、試験サンプル中のインフルエンザ抗体価を列挙するために使用されています。ウイルス力価、50％組織培養感染量（TCID 50）と卵の尿膜腔液ベースアッセイが広く使用されている1,10を計算することができます。ただし、複数の日の要件は、これらの方法は信頼性が低くなります。さらに、これらの方法でプラーク数の50％の変化に基づいて計算が正確に理論的ではなくウイルスの滴定を提供しています。アッセイをプラーク形成は、96時間以内に行うことができますが、再現性の欠如は、ウイルスの力価計算の主要な関心事である。ここで説明した本手法は、いくつかの明確な利点を持っています。まず、一貫性のある結果と再現性の高い手法である。第二に、ウイルス力価の計算は、定義された標準曲線と比較される蛍光強度のシンプルな定量化に基づいています。第三に、二つ以上の一次抗体は、与えられたサンプル中の複数の血清型を診断するために使用することができます。また、IR色素標識抗体は、ミニムを持っているら蛍光とは、細胞イメージング11に使用されています。高い量子収率内因性の蛍光物質の存在に起因する高い細胞自家蛍光のUVや視覚的な放射線（300から600 nM）の結果。これらは芳香族アミノ酸、リポ顔料、ピリジンヌクレオチド（NADPH）、エラスチン、コラーゲン、フラビン補酵素が含まれています。細胞のこの本質的なプロパティは、プローブが特定のタンパク質の発現を定量化するとして、それは困難な放射のこれらのソースを利用できるようになります。対照的に、近赤外色素は、励起と670から1000 nmの間放出されます。多くの宿主細胞分子や多環芳香族炭化水素は、この波長で励起すると低光散乱のために、極めて低いバックグラウンド蛍光を放出しない。さらに、背景と特異的検出との間のウィンドウは非常に近赤外蛍光色素の高い消光係数による改善されています。光安、優れた信号対雑音比は、ウイルス力価の定量化に非常に関連があります。 microflの使用uidic室は、ロボットコントロールを介してスクリーニングプロセスを自動化し、私たちは容易に非常に伝染性の臨床サンプルをテストする可能性があります。したがって、これらのメソッドの近赤外色素の利用は、組織サンプル中のウイルス力価を列挙するのに理想的で信頼性の高いです。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8ウイルス</td><td></td><td></td><td>博士トーマス·M·モランから</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIRDye @ 800 </td><td> LI-COR Biosciences社</td><td> 926から32210 </td><td> 1:200希釈</td></tr><tr><td> LI-CORオデッセイIRスキャナ</td><td> LI-COR-バイオサイエンス</td><td> 9201から01 </td><td></td></tr><tr><td> 384ウェル平底プレート</td><td> Nalge Nunc社国際</td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェル平底プレート</td><td> Nalge Nunc社国際</td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM培地</td><td> Invitrogen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>インビトロジェン</td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン100倍</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>インビトロジェン</td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td>抗M-2抗体</td><td></td><td></td><td>博士トーマス·M·モランから</td></tr><tr><td>抗NPモノクローナル抗体</td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> MTAを用いて得られた</td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

インフルエンザウイルスは、世界の複数の部分では毎年罹患率と死亡率の高い学位を引き起こす呼吸器病原体である。したがって、臨床サンプルの膨大な数の感染株と迅速なハイスループットスクリーニングの正確な診断は、パンデミックの感染の広がりを制御することが重要です。インフルエンザ感染症の現在の臨床診断は血清学的検査、ポリメラーゼ連鎖反応、直接試料の免疫および細胞培養1,2に基づいています。 ここでは、ライブのインフルエンザウイルスを検出するために用いられる新規な診断技術の開発について報告する。我々は、MDCK細胞4を使用して、この手法の有効性をテストするためにマウスに適合した人間A/PR/8/34（PR8、H1N1）ウイルス3を使用していました 。 MDCK細胞（ウェルあたり10 4または5×10 3）96中で培養した-またはPR8とウイルスタンパク質に感染した384ウェルプレートでは、IR色素標識秒、続いて抗M2を使用して検出された二次抗体。 M2 5ヘマグルチニン1は 、さまざまな診断アッセイに使用される2つの主要なマーカー蛋白質である。採用したIR-色素コンジュゲート二次抗体は、他の蛍光色素に関連付けられた蛍光を最小限に抑える。抗M2抗体の使用は、私たちは、ウイルス量の直接的な指標として抗原特異的な蛍光強度を使用することができました。蛍光強度を列挙するには、我々は、LI-CORオデッセイベースの赤外線スキャナを使用していました。このシステムは、蛍光物質を識別し、バックグラウンドノイズと区別するために2つのチャネルのレーザーベースのIRの検出を使用しています。最初のチャンネルは680 nmで励起し、バックグラウンドを定量化するために700 nmで発光する。番目のチャネルは780 nmで蛍光体を励起を検出し、800 nmで発光する。 IRスキャナでPR8感染MDCK細胞のスキャンは、ウイルスの力価に依存明るい蛍光を示した。 10 2 -10 5 PFUから始めてウイルス力価の蛍光強度の正の相関がCONかもしれませんsistently観察した。一貫して10 2 -10 3 PFU PR8ウイルス力価で見られた最小限のしかし、検出可能な陽性は近赤外色素の高感度を示した。信号対雑音比はモック感染またはアイソタイプ抗体処理MDCK細胞を比較することによって決定されました。 96からの蛍光強度を使用して - または384ウェルプレートフォーマットを、我々は標準的な滴定曲​​線を構築した。番目の変数は、蛍光強度でありながら、これらの計算では、最初の変数は、ウイルス力価である。したがって、我々は、ウイルス力価および蛍光強度の間に多項式の関係を決定するためにカーブフィットを生成するために指数分布を使用していました。総称して、我々はIR染料ベースのタンパク質検出システムは、ウイルス株を感染の診断と正確に感染する病原体の力価を列挙助けることができると結論する。

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

この方法は、高感度で感染マウスの気管支肺胞洗浄（BAL）液中のH1N1を検出するための赤外線染料ベースのイメージングシステムの使用方法について説明します。試験材料の&lt;10μlの体積を必要とし、複数の病原体の同時スクリーニングのための可能性を秘めている、または384ウェルプレート - この方法論は、96で行うことができ

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

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の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

インフルエンザのためのDNAマイクロアレイ上ampliPHOX比色検出

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

豚からのインフルエンザAウイルスの検出および単離のための鼻ワイプ

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

エスケープ中和抗体でインフルエンザ ウイルスの亜種の世代

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...