Name: high-throughput detection method for influenza virus
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection Method for Influenza Virus at JoVE.com

Dette arbeidet støttes delvis NIH tilskudd R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (til SM). Vi takker våre laboratorier medlemmer for diskusjon og teknisk hjelp, Tina Heil for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Vi ønsker å takke David Bina, Milwaukee Health Department Laboratorium for virus kultur og PCR.

<ol>
	<li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus.">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+(PR8)+Influenza+Virus.">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus.">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li><li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+(H5N1)+viruses+using+a+pyrosequencing+method.">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Directigen+flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season.">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li><li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence.">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li><li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR:+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+(FLU+OIA).">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li><li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+into+the+infrared.">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li><li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Den nylige epidemi utbrudd av aviær influensa i Sørøst-Asia og en global frykt for svineinfluensa pandemien pålegge enorme bekymringene til offentlig helse og sikkerhet. Kritisk fokus har vært dedikert i å generere vaksiner for eksisterende og nyere varianter av influensavirus. Tilgjengelighet av raske high-throughput teknologier for presis påvisning og nøyaktige virale titer beregninger vil enormt forbedre behandlingen. De mest brukte teknikkene benyttes til å beregne virus titer inkluderer plakk forming og influensa hemagglutination analyser. Den plakk danner analysen ble først utviklet for å beregne bakteriofag titere og ble adoptert av Renato Dulbecco å beregne dyr viral titere 4. For å utføre denne analysen, er 10-fold fortynninger av influensa lager eller dyr prøvene som BAL væske forberedt og 0,1 ml alikvoter er inokulert på monolayer av MDCK celler i seks-brønns plater. Viruset er lov til å adsorberes på de MDCK cellene etterfulgt av annonsendition av et næringsstoff medium og agarose. Under inkubasjon de opprinnelige infiserte cellene slipper viral avkom som spres bare til nabocellene. Den cytopathogenic Effekten av influensa virusinfeksjon produserer en sirkulær sone av infiserte celler som kalles en plakett. Hver plakk er trolig dannet etter infeksjon av en enkelt celle med en enkelt virus partikkel etterfulgt av replikering av virus. Kontrasten mellom de levende cellene og plaketter kan bli styrket ved fargestoffer som krystallfiolett. En stor ulempe med denne analysen er manglende reproduserbarhet og store variasjoner innenfor eksperimenter. En annen test som benyttes til å bestemme influensa viral titer er hemagglutination analysen. Den hemagglutinin protein som finnes på overflaten av influensavirus binder effektivt til N-acetylneuraminic syre-holdige proteiner på pattedyr og aviær røde blodlegemer 1. Dette samspillet mellom influensavirus og erytrocytter fører til agglutinasjon i form av et gitter. Det lEvel av agglutinasjon brukes til å anslå titer av influensavirus i prøvestykkene. Erytrocytt agglutinasjon analysen brukes kun til å bestemme titrering av en kjent virus og kan ikke brukes for belastning identifikasjon. Siden denne analysen ikke skiller mellom levende og døde virus, er det vanskelig å få en presis beregning av viral titere. Aktuelle kliniske diagnoser av influensa infeksjoner er basert på serologisk testing, polymerase kjedereaksjon, direkte prøven immunfluorescens og cellekultur 1,6. Den nye metoden som beskrives her har også klinisk og laboratoriemessig diagnostikk potensial. Influensa deteksjon kits Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) og BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) bruk immunochromatography analyse for å påvise viral antigen som nucleoprotein 7. Ved hjelp av disse pakkene, påvisning av virus kan oppnås innen 15 min, men alle negative prøver å være ytterligere screened av cellekultur metoden. Ulike studier har også rapportert lav følsomhet av disse pakkene, spesielt, da infeksjon var mild eller lav 8. I vår metode, vi konsekvent oppdage så lavt som 100 PFU av virus. Dette tyder på vår teknikk er nyttig i å avdekke H1N1-viruset i kliniske prøver, selv når infeksjonen er mild. En fluorescens-basert metode for å oppdage virus antigener har blitt rapportert, hvor enten nasofaryngeale aspirer prøvene ble direkte analysert eller ble inokulert på en monolayer av mottakelige celler for virus multiplikasjon og påfølgende analyser 9. Imidlertid er disse metodene begrenset for diagnostiske formål og er ikke egnet for virus titer beregninger. Q-PCR bidrar til å identifisere tilstedeværelsen av virus RNA og ikke anslå ikke smittsomhet av levende virus. Sammenlignet med disse prøvene, vil IR dye-basert analysen system bidra i deteksjon og viral titer telling i kliniske og laboratorieprøver. I tilfelle av influensa utbrudd, er detkritisk for å diagnostisere tusenvis av prøver i en kort tidsperiode. Vår metode basert på en 384-brønns plate og IR skanner kan skanne 6-plater i en tid (&gt; 2.000 prøver), derfor tilbyr en større fordel fremfor andre direkte fluorescerende metoder. Mulighetsstudie av rask behandling av tusenvis av kliniske prøver kan redusere test variasjon, lengde på analysen tid og kostnader. Bruken av en M2-spesifikt antistoff har den fordelen av å være uavhengig av belastningsskader forskjeller i H og N proteiner. M2-protein er relativt bevart i de fleste influensastammer infiserer mennesker. Hvis antistoffer som er spesifikke for sirkulerende flekker er kombinert med vårt system kan man måle både titer av virus og identifisere belastningen. Men siden M2 er målet for de Amantadin-lignende medikamenter, kan mutanter oppstå som kan endre bindingssetene for MAB brukt her. Dette representerer en potensiell begrensning for dette systemet hos personer som behandles med disse legemidlene. Multippelanalyser brukes til å nummerere influensa titere i stikkprøvene. For å beregne virus titer, 50% vevskultur smittsom dose (TCID 50) og egg allantoic væske-baserte analyser er mye brukt 1,10. Men kravene i flere dager gjør disse metodene mindre pålitelig. Videre i disse metodene beregninger basert på 50% endring i antall plakk gir teoretiske, men ikke nøyaktig viral titreringer. Plakk forming analyser kan utføres innen 96 timer, men er mangel på reproduserbarhet en stor bekymring i viral titer beregninger. Den nåværende teknikken som beskrives her har flere klare fordeler. Først er det en svært reproduserbar teknikk med konsistente resultater. Sekund, virale titer Beregningene er basert på enkle kvantifisering av fluorescens intensiteter som blir sammenlignet mot definerte standard kurver. Tredje, kan to eller flere primære antistoffer brukes til å diagnostisere flere serotyper i en gitt prøve. Også IR dye-konjugerte antistoffer har minimal autofluorescens og har vært brukt til celle bildebehandling 11. UV eller visuell stråling (300-600 nM) resulterer i høy mobilnettet autofluorescens grunn av tilstedeværelsen av høye quantum avkastning endogene fluorophores. Disse inkluderer aromatiske aminosyrer, Lipo-pigmenter, pyridinic nukleotider (NADPH), elastin, kollagen og Flavin koenzymer. Dette iboende egenskap av celler gjør det vanskelig å utnytte disse kildene til stråling som prober å kvantifisere uttrykket av spesifikke proteiner. I kontrast, nær-IR fargestoffer begeistre og slipper ut mellom 670-1000 nm. Mange vert cellulære molekyler og polyaromatiske hydrokarboner ikke opphisse på dette bølgelengde og på grunn av redusert lysspredning, avgir svært lav bakgrunnsfluorescens. Videre er vinduet mellom bakgrunnen og spesifikk påvisning kraftig forbedret på grunn av en høy utryddelse koeffisient av de nær-IR fluorophores. Fotostabilitet, overlegen signal-til-støy-forhold, er svært relevant i kvantifisering av viral titere. Bruk av microfluidic kamre vil automatisere screening prosessen gjennom robot kontroller, og kan tillate oss å teste svært smittsom kliniske prøver med letthet. Dermed er bruken av nær-IR fargestoffer i disse metodene ideelle og svært pålitelig for å spesifisere viral titere i vevsprøver.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Bovine serum albumin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 virus </td><td></td><td></td><td> Fra Dr Thomas M Moran </td></tr><tr><td> Goat anti-mus IRDye @ 800 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 fortynning </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR skanner </td><td> LI-COR-biovitenskap </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384-brønner flat bunnplate </td><td> Nalge Nunc internasjonal </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-brønner flat bunnplate </td><td> Nalge Nunc internasjonal </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbikarbonat </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium Pyruvat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2 antistoff </td><td></td><td></td><td> Fra Dr Thomas M Moran </td></tr><tr><td> Anti-NP MAB </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Oppnås med en MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

Influensa virus er en luftveissykdom patogen som forårsaker en høy grad av sykelighet og dødelighet hvert år i flere deler av verden. Derfor er presis diagnose av infisere belastning og raske high-throughput screening av store mengder kliniske prøver viktig for å kontrollere spredningen av pandemisk infeksjoner. Aktuelle kliniske diagnoser av influensa infeksjoner er basert på serologisk testing, polymerase kjedereaksjon, direkte prøven immunfluorescens og cellekultur 1,2. Her rapporterer vi utviklingen av en roman diagnostisk teknikk som brukes til å oppdage live influensavirus. Vi brukte musen tilpasset menneskelig A/PR/8/34 (PR8, H1N1)-viruset 3 for å teste effekten av denne teknikken bruker MDCK celler 4. MDCK celler (10 4 eller 5 x 10 3 per brønn) ble dyrket i 96 - eller 384-vel plater, infisert med PR8 og virale proteiner ble oppdaget ved hjelp av anti-M2 etterfulgt av en IR dye-konjugert sekgående antistoff. M2 5 og hemagglutinin en er to viktige markører proteiner som brukes i mange ulike diagnostiske analyser. Sysselsetter IR-dye-konjugerte sekundære antistoffer minimert autofluorescens assosiert med andre fluorescerende fargestoffer. Bruken av anti-M2 antistoff tillot oss å bruke den antigen-spesifikk fluorescens intensitet som en direkte beregning av viral kvantitet. For å nummerere fluorescensintensiteten vi brukt LI-COR Odyssey-baserte IR skanner. Dette systemet bruker to-kanals laser-baserte IR deteksjoner å identifisere fluorophores og skille dem fra bakgrunnsstøy. Den første kanalen Stimulerer ved 680 nm og avgir ved 700 nm for å hjelpe kvantifisere bakgrunnen. Den andre kanalen oppdager fluorophores som opphisse på 780 nm og et utslipp på 800 nm. Skanning av PR8-infiserte MDCK celler i IR skanneren indikert en viral titer-avhengig lyse fluorescens. En positiv korrelasjon av fluorescens intensitet til virus titer fra 10 2 -10 5 PFU kunne consistently observert. Minimal men påviselig positivitet konsekvent sett med 10 2 -10 3 PFU PR8 viral titere demonstrerte den høye følsomheten på nær-IR fargestoffer. Signal-til-støy-forhold ble bestemt ved å sammenligne mock-infiserte eller isotype antistoff-behandlede MDCK celler. Bruke fluorescens intensiteter fra 96 ​​- eller 384-brønns plate formater, bygget vi vanlige titrering kurver. I disse beregningene, er den første variabelen viral titer mens den andre variabelen er fluorescens intensitet. Derfor har vi brukt eksponentialfordelingen å generere en kurvetilpasning å bestemme polynomet forholdet mellom viral titere og fluorescens intensiteter. Samlet konkluderer vi at IR dye-basert protein detection system kan hjelpe diagnostisere infiserer virusstammer og presist nummerere titer av smitte patogener.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection Method for Influenza Virus at JoVE.com

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Denne metoden beskriver bruk av Infrarød fargestoffbaserte imaging system for påvisning av H1N1 i bronchioalveolar lavage (BAL) væske av infiserte mus på en høy sensitivitet. Denne metodikken kan utføres i en 96 - eller 384-brønnen plate, krever &lt;10 mL volum av testmateriale og har potensial for samtidige screening av flere patogener.

High-throughput Detection Method for influensavirus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influensa virus Formering i embryon Chicken Egg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes for influensa A virus Detection og isolering mot svine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Demontering av influensa A virus kapsider ved gradientsentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Høy throughput Påvisning av respiratoriske patogener i dyr eksemplarer av nanoskala PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influensa A Virus studier i en musemodell av infeksjon

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generasjon av Escape varianter av nøytralisere influensa Virus monoklonale antistoffer

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Rask, sikker og enkel manuell sengen nukleinsyre utvinning for påvisning av Virus i hele blodprøver

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...