Name: high-throughput detection method for influenza virus
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00
Duration: 10 min 5 s
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Este trabalho é apoiado em parte NIH concede R01 A1064826-01, Sub-19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (para SM). Agradecemos a nossos membros de laboratório para discussão e ajuda técnica, Tina Heil, pela revisão crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer a David Bina, Milwaukee Departamento de Saúde Laboratório de vírus cultura e PCR.

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	<li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus.">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Kalter, S. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+(H5N1)+viruses+using+a+pyrosequencing+method.">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Directigen+flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season.">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li><li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence.">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li><li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR:+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+(FLU+OIA).">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li><li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+into+the+infrared.">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li><li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

O surto recente epidemia de gripe aviária no Sudeste Asiático e um medo global da pandemia de gripe suína impor enormes preocupações para a saúde e segurança públicas. Enfoque crítico tem se dedicado na geração de vacinas para as estirpes existentes e mais recentes do vírus da gripe. Disponibilidade de rápidas tecnologias de alta capacidade para a detecção precisa e precisos cálculos título viral será tremendamente melhorar o tratamento. As técnicas mais comumente usados ​​empregadas para calcular título de vírus incluem ensaios de placa formadoras e influenza de hemaglutinação. O ensaio de placas formando foi desenvolvido para estimar os títulos de bacteriófagos e foi aprovado por Renato Dulbecco para calcular animais títulos virais 4. Para executar este ensaio, 10-de dobragem diluições de estoque de influenza ou espécimes animais, tais como líquido de LBA são preparadas e alíquotas de 0,1 ml são inoculadas em a monocamada de células MDCK em 6-bem placas. O vírus é permitido para adsorver sobre as células MDCK seguidos por o anúnciodição de um meio nutriente e de agarose. Durante a incubação, as células originais infectados liberar progênie viral que se espalhou apenas às células vizinhas. O efeito citopatogénico da infecção por influenza viral produz uma zona circular de células infectadas chamado de uma placa bacteriana. Cada placa bacteriana é, presumivelmente, formado após infecção de uma única célula com uma única partícula do vírus seguido pela replicação do vírus. Contraste entre as células vivas e das placas de pode ser reforçada por corantes, tais como violeta de cristal. Uma grande desvantagem deste ensaio é a falta de reprodutibilidade e enormes variações dentro de experimentos. Outro ensaio usado para determinar o título de influenza viral é a ensaio de hemaglutinação. A proteína presente hemaglutinina na superfície do vírus da gripe de forma eficiente liga-se a N-acetilneuramínico-ácido contendo proteínas sobre de mamíferos e de aviária células vermelhas do sangue 1. Esta interação entre o vírus da gripe e os eritrócitos leva a aglutinação sob a forma de uma treliça. O lEvel de aglutinação é usado para estimar o título de o vírus da gripe em amostras de teste. Ensaio de aglutinação eritrocitária é utilizada apenas para determinar a titulação de um vírus conhecido e não puder ser usadas para propósitos identificação da estirpe. Uma vez que este ensaio não faz diferença entre o ao vivo e os vírus de mortas, é difícil para se obter um cálculo exacto da os títulos virais. Atuais diagnósticos clínicos de infecções de gripe são baseados em testes sorológicos, a reação em cadeia da polimerase, imunofluorescência direta e amostra de cultura de células 1,6. O novo método descrito aqui também tem clínica e laboratorial potencial de diagnóstico. Influenza detecção kits Directigen FLU-A. (BD Biosciences, San Jose, CA) e BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) ensaio de imunocromatografia uso para detectar o antígeno viral, como nucleoproteína 7 Usando estes kits, a detecção de vírus pode ser alcançada dentro de 15 min; no entanto, todas as amostras negativas tem que ser s ainda maiscreened pelo método de cultura de células. Vários estudos também relataram baixa sensibilidade desses kits, particularmente, quando a infecção foi leve ou baixo 8. Em nosso método, nós consistentemente detectar preço tão baixo quanto 100 PFU de vírus. Isto sugere a nossa técnica é útil na detecção de vírus H1N1 em amostras clínicas, mesmo quando a infecção é leve. Um método de fluorescência-Based para detectar antígenos virais tem sido relatada, onde ou tomas de aspirado de secreção nasofaríngea foram diretamente analisados ​​ou foram inoculados em uma monocamada de células suscetíveis para a multiplicação do vírus e análises subseqüentes 9. No entanto, estes métodos estão limitados para fins de diagnóstico e não são adequados para os cálculos de título de vírus. Q-PCR ajuda a identificar a presença de RNA viral e não consegue estimar o grau de infecciosidade do vírus vivos. Comparado a esses ensaios, IR sistema de ensaio à base de corantes vai ajudar na detecção e enumeração título viral em amostras clínicas e laboratoriais. Em caso de surto de influenza, écrítico para diagnosticar milhares de amostras em um período de tempo curto. Nosso método baseado em uma placa de 384 poços e scanner IR pode digitalizar 6 placas em um tempo (&gt; 2.000 amostras), portanto, oferecendo uma maior vantagem sobre outros métodos diretos fluorescentes. Viabilidade de processamento rápido de milhares de amostras clínicas poderiam reduzir a variabilidade teste comprimento, de tempo de ensaio e os custos. O uso de um anticorpo M2-específico oferece a vantagem de ser independente diferenças de estirpes em proteínas H e N. A proteína M2-é relativamente conservada em cepas de a maioria dos de influenza que infectam os seres humanos. Se os anticorpos específicos para as manchas que circulam são combinados com o nosso sistema de uma pode medir tanto o título de o de vírus e de identificar a estirpe. No entanto, uma vez que M2 é o alvo para os fármacos que Amantadine-like, os mutantes pode surgir que poderia alterar o sítio de ligação para o mAb usados ​​aqui. Isto representa uma limitação potencial para este sistema em indivíduos que estão sendo tratados por essas drogas. Múltiploensaios são usados ​​para enumerar os títulos de influenza em amostras de teste. Para calcular vírus da titulação, a dose de cultura 50% de tecido infecciosa (TCID 50) e de ovos alantóide fluido baseados em ensaios de são amplamente utilizados 1,10. Contudo, as necessidades de vários dias fazer estes métodos menos confiáveis. Além disso, em estes métodos de cálculos baseados sobre a alteração de 50% no número de placas de fornecer teóricas, mas, não precisas titulações virais. Placa formando ensaios podem ser realizados dentro de 96 horas, no entanto, a falta de reprodutibilidade é uma grande preocupação em cálculos título viral. A presente técnica descrita aqui tem várias vantagens distintas. Primeiro, é uma técnica altamente reprodutível e com resultados consistentes. Em segundo lugar, cálculos título viral são baseados em quantificação simples de intensidades de fluorescência que são comparados contra definidas curvas padrão. Em terceiro lugar, dois ou mais anticorpos primários pode ser usado para diagnosticar múltiplos sorotipos em uma dada amostra. Além disso, IR dye-conjugados anticorpos têm minimal autofluorescência e têm sido utilizados para a célula de imagem 11. UV ou visual de radiação (300-600 nM) resulta em autofluorescência celular elevada devido à presença de altos quânticos rendendo fluoróforos endógenos. Estes incluem aminoácidos aromáticos, Lipo-pigmentos, nucleotídeos piridínicos (NADPH), elastina, colágeno e coenzimas flavina. Esta propriedade intrínseca de células faz com que seja difícil de utilizar estas fontes de radiação como sondas para quantificar a expressão de proteínas específicas. Em contraste, quase IR corantes excitar e emitem entre 670-1000 nm. Moléculas hospedeiras Muitos celulares e hidrocarbonetos poliaromáticos não excitar menos este comprimento de onda e devido a espalhamento de luz reduzida, emitem fluorescência de fundo extremamente baixa. Além disso, a janela entre o plano de fundo e de detecção específico é vastamente melhorada devido a um coeficiente de extinção elevado de os fluoróforos perto de-IR. Fotoestabilidade, relação sinal-para-ruído superior, é extremamente relevante na quantificação dos títulos da reação virais. Use de microflcâmaras uidic irá automatizar o processo de seleção por meio de controles robóticos, e que pode nos permitir testar altamente contagiosas amostras clínicas com facilidade. Assim, a utilização de perto de-IR corantes nestes métodos é o ideal e altamente confiável para enumerar os títulos virais em amostras de tecido.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 vírus </td><td></td><td></td><td> De Dr. Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Goat anti-mouse IRDye @ 800 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 de diluição </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR scanner </td><td> LI-COR-biociências </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384-poços de placa de fundo plano </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-poços de placa de fundo plana </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> Meio DMEM </td><td> InvitrOgen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> Meio RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> O bicarbonato de sódio </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina-100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2 anticorpo </td><td></td><td></td><td> De Dr. Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Anti-NP mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Obtido com um MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

Vírus influenza é um patógeno respiratório que faz com que um elevado grau de morbidade e mortalidade a cada ano em múltiplas partes do mundo. Portanto, o diagnóstico preciso da cepa infectante e high-throughput screening rápido de um grande número de amostras clínicas é fundamental para controlar a propagação de infecções pandemia. Atuais diagnósticos clínicos de infecções de gripe são baseados em testes sorológicos, a reação em cadeia da polimerase, imunofluorescência direta e 1,2 espécime de cultura de células. Aqui, nós relatamos o desenvolvimento de uma técnica de romance de diagnóstico usado para detectar os vírus da gripe ao vivo. Nós utilizado o humano do mouse-adaptado A/PR/8/34 (PR8, H1N1) vírus 3 para testar a eficácia dessa técnica usando células MDCK 4. Células MDCK (10 4 ou 5 x 10 3 por poço) foram cultivados em 96 - ou placas de 384-bem, infectadas com PR8 e proteínas virais foram detectadas utilizando anti-M2 seguido por um IR dye-conjugada seganticorpo secundário. M2 5 e hemaglutinina 1 são duas proteínas marcadoras principais usados ​​em muitas diferentes ensaios de diagnóstico. Que empregam IR-dye-conjugados anticorpos secundários minimizou a autofluorescência associada com outras corantes fluorescentes. O uso de anticorpo anti-M2 permitiu-nos para usar a intensidade antígeno-específica de fluorescência como uma métrica direta de quantidade viral. Para enumerar a intensidade de fluorescência, foi utilizado o LI-COR Odyssey baseada scanner IR. Este sistema usa dois de canal detecções de baseados em laser IR para identificar fluoróforos e diferenciá-los a partir de ruído de fundo. O canal de primeira excita em 680 nm e emite menos 700 nm, para a ajudar a quantificar o plano de fundo. O segundo canal detecta fluoróforos que excitam a 780 nm e emissão a 800 nm. Digitalização de PR8-infectados células MDCK em o scanner IR indicado um de fluorescência título de-dependente viral brilhante. Uma correlação positiva da intensidade de fluorescência para título de vírus de partida a partir de 10 2 -10 5 PFU poderia ser conconsistentemente observada. Positividade Minimal, mas detectável consistentemente visto com 10 2 -10 3 PFU PR8 os títulos virais demonstraram a alta sensibilidade das tinturas de perto de-IR. A relação sinal-para-ruído foi determinada por comparando-se os mock-infectados ou isotipo de anticorpo-tratados com células MDCK. Usando as intensidades de fluorescência a partir de 96 - ou formatos de placa 384-bem, nós construídas curvas de titulação padrão. Nestes cálculos, a primeira variável é o título viral enquanto a variável segundo é a intensidade de fluorescência. Portanto, nós utilizamos a distribuição exponencial para gerar uma curva de fit-para determinar a relação polinomial entre os títulos virais e intensidades de fluorescência. Colectivamente, podemos concluir que IR à base de corantes sistema de detecção de proteína pode ajudar a diagnosticar infecção cepas virais e enumerar precisamente o título dos patógenos infectantes.

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Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

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