Name: high-throughput detection method for influenza virus
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection Method for Influenza Virus at JoVE.com

Эта работа выполнена при частичной поддержке грантов NIH R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, № 1-HHSN26600500032C (С.М.). Мы благодарим наших членов лаборатории для обсуждения помощи и технического, Тина Heil для критического анализа рукописи. Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Бина, Милуоки Департамента здравоохранения лаборатории вирус культуры и ПЦР.

<ol>
	<li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus.">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+(PR8)+Influenza+Virus.">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus.">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li><li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+(H5N1)+viruses+using+a+pyrosequencing+method.">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Directigen+flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season.">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li><li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence.">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li><li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR:+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+(FLU+OIA).">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li><li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+into+the+infrared.">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li><li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

Недавняя вспышка эпидемии птичьего гриппа в Юго-Восточной Азии и глобальный страх пандемии свиного гриппа наложить огромные проблемы для общественного здравоохранения и безопасности. Критическое внимание было посвящено в производстве вакцин для существующих и новых штаммов вируса гриппа. Наличие быстрых высокопроизводительных технологий для точного обнаружения и точный расчет вирусный титр будет в значительной степени улучшить лечение. Наиболее часто используемые методы, используемые для расчета титра вируса включает бляшкообразующих и гриппа анализы гемагглютинации. Бляшкообразующих анализа была разработана для оценки титра бактериофага и был принят Дульбекко рассчитать животных вирусные титры 4. Для выполнения этого теста, 10-кратные разведения акций гриппа или животных, таких как БАЛ готовы и 0,1 мл аликвоты засевают на монослоя MDCK клеток в 6-луночных планшетах. Вирус имеет право адсорбируются MDCK клеток следует объявлениеусловие о питательной среды и агарозы. Во время инкубации, оригинальные инфицированные клетки выделяют вирусные потомства, которые распространяются только на соседние ячейки. Цитопатогенного влияния гриппа вирусная инфекция приводит к круговой зоне зараженных клеток, называемых бляшками. Каждая доска предположительно формируется после инфицирования одной клетки с одной частицы вируса последующей репликации вируса. Контраст между живыми клетками и бляшки могут быть усилены красители, такие как фиолетовый кристалл. Основным недостатком этого анализа является отсутствие воспроизводимости и огромные различия в экспериментах. Другой тест для определения вируса гриппа титр гемагглютинации. Гемагглютинин настоящий белок на поверхности вируса гриппа эффективно связывается с N-ацетилнейраминовой кислотно-содержащих белков на млекопитающих и птиц эритроциты 1. Это взаимодействие между вирусом гриппа и эритроцитов приводит к агглютинации в виде решетки. ЛEvel агглютинации используется для оценки титр вируса гриппа в образцах. Эритроцитов анализа агглютинации используется только для определения титрования известного вируса и не может быть использована в целях идентификации штаммов. Поскольку это анализ не делает различия между живым и мертвым вирусов, трудно получить точный расчет вирусные титры. Текущий клинический диагноз гриппозной инфекции на основе серологического тестирования, полимеразная цепная реакция прямой иммунофлюоресценции образца и культуре клеток 1,6. Новый метод, описанный здесь также есть клинические и лабораторные диагностические возможности. Грипп обнаружения комплектов Directigen гриппа A (BD Biosciences, San Jose, CA) и BinaxNow (Binax, Inc, Скарборо, ME) анализ использования иммунохроматографии для выявления вирусных антигенов, таких как нуклеопротеидов 7. С помощью этих наборов, обнаружение вируса может быть достигнуто в течение 15 минут, однако все негативные образцы имеют в дальнейшем сcreened методом клеточной культуры. Различные исследования также сообщили, низкая чувствительность этих комплектов, в частности, когда инфекция была умеренной или низкой 8. В нашем методе мы последовательно обнаружить столь же низко как 100 PFU вируса. Это говорит о нашей технике полезен для обнаружения вируса H1N1 в клинических образцах, даже если инфекция мягкая. Флуоресценции на основе метода для обнаружения вирусных антигенов, как сообщается, где из носоглотки образцов аспирата были проанализированы непосредственно или были привиты на монослой чувствительные клетки для размножения вируса и последующего анализа 9. Однако эти методы ограничены в диагностических целях и не предназначены для расчета титра вируса. Q-PCR помогает определить наличие вирусной РНК и не оценить инфекционной живых вирусов. По сравнению с этим анализы, ИК на основе красителя анализ системы поможет в выявлении и вирусный титр перечисления в клинических и лабораторных образцов. В случае вспышки гриппа, эторешающее значение для диагностики тысяч образцов в течение короткого периода времени. Наш метод основан на 384-луночного планшета и ИК-сканер может сканировать 6 пластин в то время (&gt; 2000 образцов), поэтому предлагают большие преимущества по сравнению с другими прямыми люминесцентными методами. Возможность быстрой обработки тысяч клинических образцов может снизить тест изменчивость, продолжительность анализа и затрат. Использование M2-специфических антител имеет то преимущество, не зависит от деформации различия в H и N белков. М2-белка относительно сохранения в большинстве штаммов вируса гриппа инфицировать людей. Если антитела, специфичные к циркулирующим пятна в сочетании с нашей системой можно измерять как титр вируса и определения напряжения. Однако, так как M2 является мишенью для амантадина, как наркотики, мутанты могут возникнуть, которые могут изменить сайт связывания МКА использованы здесь. Это представляет собой потенциальную ограничения для этой системы у людей, которые лечатся от этих препаратов. Множественныйтесты используются для перечисления гриппа титры в опытных образцах. Для расчета титра вируса, 50% культуре ткани инфекционная доза (TCID 50) и яйца аллантоисной жидкости на основе анализов широко используется 1,10. Тем не менее, требования несколько дней сделать эти методы менее надежны. Кроме того, в этих методах расчетов, основанных на 50%, изменение числа бляшек обеспечить теоретическое, но не точно вирусных титрования. Бляшкообразующих анализов могут быть выполнены в течение 96 часов, однако, отсутствие воспроизводимости является серьезной проблемой в расчетах титр вирусной. В настоящей методике, описанной здесь есть несколько явных преимуществ. Во-первых, это высокая воспроизводимость техники с последовательным результатам. Во-вторых, вирусный титр расчеты основаны на простой количественной оценке интенсивности флуоресценции, которые сравниваются с определена стандартными кривыми. В-третьих, две или более первичные антитела могут быть использованы для диагностики нескольких серотипов в данном образце. Кроме того, ИК красителях сопряженных антитела минимфлуоресценции и др. были использованы для мобильных изображений 11. УФ-или визуальная излучения (300-600 нм) приводит к высокой сотовой флуоресценции в связи с наличием высокой квантовой урожайность эндогенных флуорофоров. К ним относятся ароматические аминокислоты, липо-пигменты, pyridinic нуклеотидов (НАДФН), эластин, коллаген и флавин коферментов. Это внутреннее свойство клеток затрудняет использование этих источников излучения в качестве зондов для количественного определения экспрессии специфических белков. В отличие от ближнего ИК красителях возбуждать и выделяют от 670-1000 нм. Многие хозяин молекул клеточной и полициклические ароматические углеводороды не возбуждают на этой длине волны и за счет снижения рассеяния света, излучают чрезвычайно низкой фоновой флуоресценции. Кроме того, окно между фоном и конкретными обнаружения значительно улучшена за счет высокого коэффициента поглощения в ближней ИК-флуорофоров. Фотостабильность, превосходное отношение сигнал-шум, является чрезвычайно актуальным в количественном вирусных титров. Использование microfluidic камер позволит автоматизировать процесс отбора через робота контроля, а также позволил бы проверить очень заразна клинических образцах с легкостью. Таким образом, использование ближней ИК красителей в этих методов является идеальным и надежным перечислить вирусные титры в образцах тканей.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Бычий сывороточный альбумин </td><td> Атланты биологические </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 вирус </td><td></td><td></td><td> С д-р Томас М. Моран </td></tr><tr><td> Антимышиного IRDye @ 800 </td><td> LI-COR биологических наук </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 разбавления </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey ИК-сканер </td><td> LI-COR-биологических наук </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384 скважин плоской нижней плиты </td><td> Nalge Nunc международных </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96 скважин нижней пластине </td><td> Nalge Nunc международных </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM среднего </td><td> InvitrOgen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI среду </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Бикарбонат натрия </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-глютамин 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-ЭДТА </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Пируват натрия </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-М-2 антител </td><td></td><td></td><td> С д-р Томас М. Моран </td></tr><tr><td> Anti-НП МКА </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Полученные с MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection Method for Influenza Virus at JoVE.com

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Этот метод описывает использование инфракрасного краситель на основе системы визуализации для выявления H1N1 в bronchioalveolar лаважа (БАЛ) зараженных мышей при высокой чувствительности. Эта методика может быть выполнена в 96 - или 384-луночного планшета, требуется &lt;10 мкл объема испытуемого материала и имеет потенциал для одновременного обследования нескольких возбудителей.

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Использование изображений Биолюминесцентный по расследованию синергизм между Пневмококк И вируса гриппа А в младенческой Мыши

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX Колориметрические обнаружения на ДНК-микрочипов по гриппу

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Грипп Вирус Распространение в куриные эмбрионы

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Носовые салфетки для гриппа обнаружения вируса и изоляции от свиного

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro разборке вируса гриппа капсиды по градиентное центрифугирование

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Высокая пропускная способность Обнаружение респираторными патогенами в образцах животных с помощью наноразмерных ПЦР

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Исследования вирусов гриппа A в мышиной модели инфекции

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Поколение побег вариантов нейтрализующих антител моноклональных вирус гриппа

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Быстрый, безопасный и простой ручной прикроватные нуклеиновой кислоты извлечения для обнаружения вируса в пробах цельной крови

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...