Name: high-throughput detection method for influenza virus
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00
Duration: 10 min 5 s
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Este trabajo es apoyado en parte, las subvenciones del NIH R01 A1064826-01, Sub-19 AI062627-01, no1-HHSN26600500032C (a SM). Agradecemos a nuestros miembros del laboratorio en busca de ayuda la discusión y el técnico, Tina Heil para la revisión crítica del manuscrito. Nos gustaría dar las gracias a David Bina, Milwaukee Departamento de Salud del Laboratorio de cultivo de virus y PCR.

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No tenemos nada que revelar.

El brote de la epidemia reciente de gripe aviar en el sudeste asiático y el temor global de la pandemia de gripe porcina imponen enormes problemas para la salud pública y la seguridad. Enfoque crítico se ha dedicado en la generación de vacunas para las cepas existentes y nuevas de virus de la influenza. La disponibilidad de los rápidos tecnologías de alto rendimiento para la detección precisa y exacta los cálculos título viral tremendamente a mejorar el tratamiento. Las técnicas más comúnmente utilizadas empleadas para calcular título del virus incluyen la placa ensayos de hemaglutinación formadoras y la influenza. El ensayo de formación de placas fue desarrollado para estimar los títulos de bacteriófagos y fue adoptado por Renato Dulbecco para el cálculo de los títulos virales de los animales 4. Para realizar este ensayo, 10-diluciones de stock de la influenza o especímenes de animales tales como líquido de BAL se preparan y alícuotas de 0,1 ml se inoculan sobre la monocapa de células MDCK a 6-y placas. El virus se permite para adsorberse sobre las células MDCK seguidos por el anunciocondición de un medio nutritivo y agarosa. Durante la incubación, las células infectadas originales liberar progenie viral que se extendió sólo a las células vecinas. El efecto citopatogénico de la infección viral de la influenza produce una zona circular de las células infectadas llamado una placa. Cada placa está presumiblemente formado después de la infección de una sola célula con una partícula de virus único seguido por la replicación del virus. Contraste entre las células vivas y placas las puede ser mejorada por los tintes tales como cristal violeta. Un inconveniente importante de este ensayo es la falta de reproducibilidad y enormes variaciones dentro de experimentos. Otro ensayo utilizado para determinar el título viral de la influenza es el ensayo de hemaglutinación. El presente proteína hemaglutinina en la superficie del virus de influenza de manera eficiente se une a la N-acetilneuramínico que contienen ácido-proteínas en células de la sangre de mamíferos y aves rojas 1. Esta interacción entre el virus de la influenza y los eritrocitos los conduce a la aglutinación en la forma de una celosía. El lEvel de aglutinación se utiliza para estimar el tıtulo del virus de la gripe en muestras de prueba. Ensayo de aglutinación eritrocitaria sólo se utiliza para determinar la titulación de un virus conocido y no puede ser usado para los propósitos identificación de la cepa. Puesto que este ensayo no hace diferencia entre el vivo y los virus muertos, es difícil para obtener un cálculo preciso de los títulos virales. Actuales diagnósticos clínicos de las infecciones de gripe se basan en pruebas serológicas, la reacción en cadena de la polimerasa, inmunofluorescencia directa de muestras y el cultivo de células de 1,6. El nuevo método descrito aquí también tiene el potencial de diagnóstico clínico y de laboratorio. Detección de la influenza kits Directigen FLU-A. (BD Biosciences, San Jose, CA) y BinaxNOW (Binax, Inc., Portland, ME) ensayo de uso inmunocromatografía para detectar el antígeno viral, como la nucleoproteína 7 El uso de estos equipos, la detección del virus se puede lograr en los 15 minutos, sin embargo, todas las muestras negativas tienen que ser más screened por el método de cultivo celular. Diversos estudios también han informado de una baja sensibilidad de estos kits, en particular, cuando la infección fue leve o baja 8. En nuestro método, hemos consistentemente detectar un precio tan bajo como 100 UFP de virus. Esto sugiere que nuestra técnica es útil en la detección de virus H1N1 en muestras clínicas, incluso cuando la infección es leve. Un método basado en la fluorescencia para detectar antígenos virales se ha informado, donde ya sea especímenes aspirado nasofaríngeo se analizaron directamente o se inocularon en una monocapa de células susceptibles a la multiplicación del virus y los análisis posteriores 9. Sin embargo, estos métodos están limitados para propósitos de diagnóstico y no son adecuadas para los cálculos de título del virus. Q-PCR ayuda a identificar la presencia de ARN viral y no estimar la infectividad de virus vivos. En comparación con estos ensayos, IR con base de tinte sistema de análisis ayudará en la detección y la enumeración de título viral en muestras clínicas y de laboratorio. En caso de brote de influenza, escrítico para diagnosticar miles de muestras en un período de tiempo corto. Nuestro método basado en una placa de 384 pocillos y un escáner de infrarrojos puede escanear 6 placas a la vez (más de 2.000 muestras), por lo tanto ofrece una mayor ventaja sobre otros métodos de inmunofluorescencia directa. Viabilidad de la tramitación rápida de las miles de muestras clínicas podría reducir la variabilidad de ensayo, la duración del tiempo de ensayo y los costes. El uso de un anticuerpo M2-específico ofrece la ventaja de ser independiente de la cepa diferencias en las proteínas H y N. La proteína M2-está relativamente conservada en la mayoría de las cepas de influenza que infectan a los seres humanos. Si los anticuerpos específicos a las manchas circulantes se combinan con nuestro sistema de una puede medir tanto el título de virus e identificar la cepa. Sin embargo, desde M2 ​​es el objetivo para los fármacos amantadina-como, los mutantes pueden surgir que podrían cambiar el sitio de unión para el mAb utilizado aquí. Esto representa una limitación potencial de este sistema en los individuos que están siendo tratados por estas drogas. MúltipleLos ensayos se utilizan para enumerar los títulos de la gripe en muestras de ensayo. Para calcular el virus de la titulación, el 50% de la dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID 50) y de huevo líquido alantoideo ensayos basados ​​son ampliamente utilizados 1,10. Sin embargo, los requisitos de días múltiples hacer estos métodos menos fiables. Además, en estos métodos de cálculos basados ​​en el cambio de 50% en el número de placas proporcionar titulaciones virales teóricas pero no exacta. La placa que forma los ensayos se pueden realizar dentro de las 96 horas, sin embargo, la falta de reproducibilidad es una preocupación importante en los cálculos del título viral. La presente técnica descrita aquí tiene varias ventajas distintivas. En primer lugar, es una técnica altamente reproducible con resultados consistentes. En segundo lugar, los cálculos de título viral se basan en la simple cuantificación de la intensidad de fluorescencia que se comparan contra los definidos por las curvas de calibración. En tercer lugar, dos o más anticuerpos primarios se puede utilizar para diagnosticar múltiples serotipos en una muestra dada. Además, IR tinte conjugado con anticuerpos tienen minimAl autofluorescencia y se han utilizado para la celda de imagen 11. UV o visual de radiación (300-600 nM) resulta en autofluorescencia alta celular debido a la presencia de altos cuánticos endógenos fluoróforos rendimiento. Estos incluyen los aminoácidos aromáticos, los pigmentos de lipo, nucleótidos piridínico (NADPH), la elastina, colágeno y coenzimas Flavin. Esta propiedad intrínseca de las células hace que sea difícil de utilizar estas fuentes de radiación como sondas para cuantificar la expresión de proteínas específicas. En contraste, cerca-IR tintes excitar y emiten entre 670-1000 nm. Muchas moléculas celulares de acogida e hidrocarburos aromáticos policíclicos no excitan en esta longitud de onda y debido a la dispersión de la luz reducida, emiten fluorescencia de fondo extremadamente bajo. Además, la ventana entre el fondo y detección específica se mejoró enormemente debido a un alto coeficiente de extinción de los fluoróforos cerca-IR. Fotoestabilidad, superior señal-a-ruido, es extremadamente relevante en la cuantificación de los títulos virales. El uso de microflcámaras uidic automatizará el proceso de selección a través de controles robóticos, y podría permitir poner a prueba las muestras clínicas altamente contagiosas con facilidad. Así, la utilización de los cerca-IR colorantes en estos métodos es ideal y muy fiable para enumerar los títulos virales en muestras de tejido.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 virus de la </td><td></td><td></td><td> Desde el Dr. Thomas M. Moran </td></tr><tr><td> Cabra anti-ratón IRDye @ 800 </td><td> LI-COR biociencias </td><td> 926-32210 </td><td> Dilución 1:200 </td></tr><tr><td> LI-COR IR escáner Odyssey </td><td> LI-COR-biociencias </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384 pozos de la placa de fondo plano </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96 pozos de la placa de fondo plano </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> Medio DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> Medio RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> De bicarbonato de sodio </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina 100 veces </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio Piruvato </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2 de anticuerpos </td><td></td><td></td><td> Desde el Dr. Thomas M. Moran </td></tr><tr><td> Anti-NP MAB </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Se obtiene por un MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

Virus de la gripe es un patógeno respiratorio que causa un alto grado de cada año, la morbilidad y la mortalidad en varias partes del mundo. Por lo tanto, el diagnóstico preciso de la cepa infectante y la detección rápida de alto rendimiento de un gran número de muestras clínicas es fundamental para controlar la propagación de las infecciones de la pandemia. Actuales diagnósticos clínicos de las infecciones de gripe se basan en pruebas serológicas, la reacción en cadena de la polimerasa, inmunofluorescencia directa de muestras y 1,2 de cultivo celular. Aquí, se presenta el desarrollo de una nueva técnica de diagnóstico utilizada para detectar virus vivos de influenza. Hemos utilizado la humana adaptada a ratón A/PR/8/34 (PR8, el H1N1) virus de la 3 para probar la eficacia de esta técnica utilizando células MDCK 4. Células MDCK (10 4 o 5 x 10 3 por pocillo) se cultivaron en 96 - o placas 384-así, infectados con PR8 y proteínas virales se detectaron utilizando anti-M2 seguido por un IR tinte-conjugado seganticuerpo secundario. M2 5 y la hemaglutinina 1 son dos proteínas marcadoras principales que se utilizan en muchas pruebas de diagnóstico diferentes. El empleo de IR-dye-conjugado con anticuerpos secundarios minimizó la autofluorescencia asociado con otros tintes fluorescentes. El uso de anticuerpos anti-M2 nos permitió utilizar la intensidad de fluorescencia antígeno-específica como un indicador directo de la cantidad de virus. Para enumerar la intensidad de fluorescencia, se utilizó el LI-COR Odyssey basado en escáner de infrarrojos. Este sistema utiliza dos canales de detección basados ​​en láser de infrarrojos para identificar fluoróforos y diferenciarlos del ruido de fondo. El primer canal excita a 680 nm y emite a 700 nm para ayudar a cuantificar el fondo. El segundo canal detecta fluoróforos que excitan a 780 nm y emisión a 800 nm. Escaneo de PR8-las células infectadas MDCK en el escáner de infrarrojos indicó un título viral dependiente de fluorescencia brillante. Una correlación positiva de intensidad de fluorescencia a título del virus a partir de 10 2 -10 5 UFP podría ser de Conconsistentemente observado. Positividad mínima detectable, pero siempre visto con 10 2 -10 3 UFP PR8 títulos virales demostrado la alta sensibilidad de los tintes de infrarrojo cercano. La relación señal-ruido se determinó mediante la comparación de los mock-infectados o isotipo tratados con anticuerpo-células MDCK. Uso de las intensidades de fluorescencia de 96 - o formatos de placas de 384 pocillos, se construyeron las curvas estándar de valoración. En estos cálculos, la primera variable es el título viral, mientras que la segunda variable es la intensidad de la fluorescencia. Por lo tanto, hemos utilizado la distribución exponencial para generar una curva de ajuste para determinar la relación polinomio entre los títulos virales e intensidades de fluorescencia. En conjunto, llegamos a la conclusión de que IR con base de tinte sistema de detección de la proteína puede ayudar a diagnosticar las cepas de virus infectante y precisa enumerar el título de los patógenos que infectan.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

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