Name: high-throughput detection method for influenza virus
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection Method for Influenza Virus at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis NIH bidrag R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (till SM). Vi tackar våra laboratorium medlemmar för diskussion och teknisk hjälp, Tina Heil för kritisk granskning av manuskriptet. Vi vill tacka David Bina, Milwaukee Health Department Laboratoriet för virusodling och PCR.

<ol>
	<li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus.">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+(PR8)+Influenza+Virus.">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus.">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li><li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+(H5N1)+viruses+using+a+pyrosequencing+method.">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%+or+plaque+forming+units.">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li><li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Directigen+flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season.">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li><li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A+B+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence.">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li><li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR:+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+(FLU+OIA).">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li><li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+into+the+infrared.">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li><li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

Den senaste epidemin utbrott av fågelinfluensa i Sydostasien och en global rädsla för svininfluensan pandemin innebära enorma problem för människors hälsa och säkerhet. Kritisk fokus har ägnats att skapa vaccin för befintliga och nya stammar av influensavirus. Tillgång till snabba teknik med hög kapacitet för exakt detektering och noggranna virala beräkningar titer kommer oerhört förbättra behandlingen. De mest vanligen använda tekniker som utnyttjas för att beräkna-virus-titer inkludera plackbildande-och influensa hemagglutination-analyser. Plattan bildar analysen utvecklades först för att uppskatta bakteriofag titer och antogs av Renato Dulbecco för att beräkna djurens virustitrar 4. För att utföra denna analys, är 10-faldiga spädningar av influensa lager eller exemplar djur såsom BAL-vätska förberedd och 0,1 ml alikvoter inokuleras på monoskiktet av MDCK celler i 6-brunnsplattor. Det virus tillåts att adsorbera på de MDCK-celler följt av den adskicket av ett näringsmedium och agaros. Under inkuberingen, de ursprungliga infekterade cellerna frisätta viral avkomma som spred endast till de angränsande celler. Den cytopatogena effekten av den influensapositiva viral infektion producerar en cirkulär zon av infekterade celler som kallas ett plack. Varje plack är förmodligen bildad efter infektion av en enda cell med en enda virus partikel följt av replikation av-virus. Kontrast mellan de levande celler och de plaketter kan förstärkas genom att färgämnen såsom kristallviolett. En stor nackdel med denna analys är brist på reproducerbarhet och enorma variationer inom experiment. En annan analys som användes för att bestämma den influensa virala titern är den hemagglutineringsanalys. Den hemagglutininproteinet närvarande på ytan av det influensa-virus binder effektivt till N-acetylneuramin-syra-haltiga proteiner på däggdjurs-och aviär röda blodkroppar 1. Denna interaktion mellan det influensavirus och de erytrocyterna leder till agglutinering i form av ett gitter. Den l.Evel av agglutinering används för att uppskatta den titer av den influensa viruset i provkroppar. Erytrocyt agglutination assay används endast för att bestämma titrering av ett känt virus och kan inte användas för stammarnas registreringsnummer. Eftersom denna analys inte skilja mellan levande och de döda virus, är det svårt att få en exakt beräkning av virala titrar. Nuvarande kliniska diagnoser av influensainfektioner är baserade på serologisk testning, polymeras-kedjereaktion, direkta provexemplaret immunofluorescens och cellkultur 1,6. Den nya metoden som beskrivs här också har klinisk och laborativ diagnostiska potential. Influensa upptäckt kit Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) och BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) använder immunokromatografi analys för att upptäcka viralt antigen såsom nukleoprotein 7. Med hjälp av dessa kit, detektion av virus kan uppnås inom 15 minuter, men alla negativa prover måste ytterligare screened genom att den cell kulturen-metoden. Olika studier har också rapporterat låg sensitivitet av dessa kit, i synnerhet när infektion var milt eller låg 8. I vår metod, detektera vi konsekvent så låg som 100 PFU av-virus. Detta tyder på vår teknik är användbar för att upptäcka H1N1-viruset i kliniska prover, även när infektionen är mild. En fluorescens-baserad metod för att upptäcka virala antigener har rapporterats, där antingen nasofaryngeala aspirat prover analyseras direkt eller ympades på ett monoskikt av mottagliga celler för virus förökning och efterföljande analyser 9. Men dessa metoder begränsade för diagnostiska ändamål och är inte lämpliga för beräkningar virustiter. Q-PCR-hjälper till att identifiera närvaron av viralt RNA och går inte uppskatta den infektiviteten av levande virus. Jämfört med dessa analyser kommer IR färgpulverbaserat analyssystem hjälp i att upptäcka och virustiter uppräkningen i kliniska och laboratorieprover. I händelse av influensa utbrott, är detkritisk för att diagnostisera tusentals prover i en kort tidsperiod. Vår metod bygger på en 384-brunnar och IR scanner kan scanna 6-plattor åt gången (&gt; 2000 prover), och således erbjuder ett större fördel jämfört med andra direkta fluorescerande metoder. Genomförbarheten av en snabb behandling av tusentals kliniska prover kan minska testet variation, längd av analys tid och kostnader. Användningen av ett M2--specifik antikropp erbjuder fördelen av att vara oberoende av stamskillnader i H-och N-proteiner. M2-proteinet är relativt bevarad i de flesta influensastammar infekterar människor. Om så antikroppar som är specifika för att cirkulerande fläckar tas kombineras med vårt system en kan mäta både den titem av viruset och identifiera den-stammen. Eftersom M2 är målet för Amantadin-liknande läkemedel kan mutanter uppstå som kan ändra bindningsstället för mAb som används här. Detta representerar en potentiell begränsning för den här system i individer som håller på att behandlade genom dessa droger. Multipelanalyser används för att räkna influensa titrar i testprover. För att beräkna-virus-titer, 50% vävnadskultur infektiös dos (TCID 50) och sektorn för ägg allantoiska fluidum-baserade analyser användes i stor utsträckning 1,10. Men kraven på flera dagar att göra dessa metoder mindre tillförlitlig. Vidare, i dessa metoder beräkningar som baseras på 50% förändring av antalet plack ge teoretiska, men inte exakt virala titreringar. Plackbildande analyser kan utföras inom 96 timmar, men är bristen på reproducerbarhet ett stort problem i virustiter beräkningar. Den föreliggande teknik som beskrivs här har flera distinkta fördelar. Först, är det en höggradigt reproducerbar teknik med konsekventa utfall. Andra, den virala antikroppnivåvärden Beräkningarna är baserade på enkel kvantifiering av fluorescensintensiteter som jämförs mot definierade standardkurvor. Tredje, kan två eller flera primära antikroppar användas för att diagnostisera multipla serotyper i ett givet prov. Också, IR-färgämne-konjugerade antikroppar har halvpausfl autofluorescens och har använts för cell imaging 11. UV-eller visuell strålning (300-600 nM) resulterar i hög cellulär autofluorescens på grund av närvaron av höga quantum avkastningsvalutor endogena fluoroforer. Dessa inkluderar aromatiska aminosyror, Lipo-pigment, pyridinic nukleotider (NADPH), elastin, kollagensjukdomar och flavin koenzymer. Den här inneboende egenskapen hos celler gör det svårt att utnyttja dessa källor till strålning som prober för att kvantifiera den expressionen av specifika proteiner. I motsats nära-IR färgämnen väcka och släpper mellan 670-1000 nm. Många värd cellulära molekyler och polyaromatiska kolväten inte hetsas inte denna våglängd och på grund av minskad ljusspridning, släpper extremt låg bakgrundsfluorescens. Ytterligare, är fönstret mellan bakgrunden och specifika detektionen vastly förbättrades på grund av en hög extinktionskoefficient av de i närheten av-IR-fluoroforer. Fotostabilitet, överlägsen signal-till-brus-förhållande, är extremt relevant i den kvantifiering av virala titrar. Bruk av microfluidic kamrar automatiserar screening processen genom robot kontroller och kunde tillåta oss att testa mycket smittsamma kliniska prover med lätthet. Sålunda, är utnyttjandet av i närheten av-IR-färgämnena i dessa metoder idealisk och mycket tillförlitlig att uppräkna virala titrar i vävnadsprover.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på den reagenset </td><td> Bolaget </td><td> Katalognummer </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8-virus </td><td></td><td></td><td> Från Dr Thomas M Moran </td></tr><tr><td> Get anti-mus IRDye @ 800 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32.210 </td><td> 1:200 utspädning </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR scanner </td><td> LI-COR-Biosciences </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384-brunnar plan botten platta </td><td> Nalge Nunc internationell </td><td> 164.730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-brunnar plan botten platta </td><td> Nalge Nunc internationell </td><td> 165.305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-medium </td><td> Invitrögen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI-medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium-bikarbonat </td><td> Invitrogen </td><td> 25.080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25.030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA- </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium-Pyruvat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2-antikropp </td><td></td><td></td><td> Från Dr Thomas M Moran </td></tr><tr><td> Anti-NP mAb </td><td> CDC: </td><td> V2S2208 </td><td> Erhålles med en MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection method for influenza virus

Influensa-virus är en respiratorisk patogen som orsakar en hög grad av morbiditet och mortalitet varje år i multipla delar av världen. Därför, är precisa diagnos av den infekterande-stammen och snabba high-throughput screening av stora skarorna av kliniska prover av största vikt för att kontrollera spridningen av pandemiska infektioner. Nuvarande kliniska diagnoser av influensainfektioner är baserade på serologisk testning, polymeras-kedjereaktion, direkta provexemplaret immunofluorescens och cellkultur 1,2. Här, rapportera vi utvecklingen av en roman diagnostisk teknik användas för att detektera levande influensavirus. Vi använde mus-anpassad människa A/PR/8/34 (PR8, H1N1)-viruset 3 för att testa effekten av denna teknik att använda MDCK celler 4. MDCK-celler (10 4 eller 5 x 10 3 per brunn) odlades i 96 - eller 384-brunnars plattor, infekterade med PR8 och virala proteiner detekterades med användning av anti-M2-följt av ett IR-färgämne-konjugerad sekondary antikropp. M2 5 och hemagglutinin 1 är två stora markörproteiner användas i många olika diagnostiska analyser. Som sysselsätter IR-färgämne-konjugerade sekundära antikroppar minimerat den autofluorescens associerad med andra fluorescerande färgämnen. Den användningen av anti-M2-antikropp tillät oss att använda den antigen-specifik fluorescens intensiteten som en direkt metrisk av viral kvantitet. Att räkna fluorescensintensiteten använde vi LI-COR Odyssey-baserad IR scanner. Detta system använder två kanaler laserbaserade IR detekteringar att identifiera fluoroforer och skilja dem från bakgrundsljud. Den första kanalen hetsar vid 680 nm och emitterar vid 700 nm för att hjälpa kvantifiera bakgrunden. Den 2:a-kanalen detekterar fluoroforer om att exciterar vid 780 nm och emittera vid 800 nm. Scanning av PR8-infekterade MDCK-celler i den IR-scannern indikerade en virala titern-beroende ljusstark fluorescens. En positiv korrelation mellan fluorescensintensiteten för att virus titer med utgångspunkt från 10 2 -10 5 PFU kan vara konkvent observeras. Minimal men detekterbara positivitet ses konsekvent med 10 2 -10 3 PFU PR8 virustitrar visade mycket känsliga nära IR färgämnen. Den signal-till-brus förhållandet bestämdes genom att jämföra de mock-infekterade eller isotyp antikropp-behandlade MDCK-celler. Med användning av de fluorescensintensiteterna från 96 - eller 384-brunnars formaterar plate, konstruerade vi schablonvärden vid titrerkurvorna. I dessa beräkningar, är den 1:e variabeln det virala titem medan den 2:a variabeln är den fluorescensintensitet. Därför, använde vi den exponentiella distributionen för att generera en kurva-fit-för att bestämma den polynomet relationen mellan de virala titrarna och fluorescens intensiteter. Sammantaget drar vi slutsatsen att IR färgpulverbaserat protein upptäckt system kan hjälpa till att diagnostisera infektera virusstammar och exakt räkna titern av de infekterande patogener.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection Method for Influenza Virus at JoVE.com

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Denna metod beskriver den användningen av Infraröd-färgämne baserade bildgivande system för detektion av H1N1 i bronchioalveolar sköljning (BAL) fluidum av infekterade möss vid en hög känslighet. Denna metodik kan utföras i en 96 - eller 384-brunnars platta, kräver &lt;10 | il volym av testmaterial och har potential för samtidig screening av multipla patogener.

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX Kolorimetriska Detection på en DNA microarray för influensa

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influensa viruspropagering i embryonerade hönsägg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes för influensa A-virus Upptäckt och isolering från svin

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

I vitro Demontering av influensa A-virus-kapsider genom gradientcentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hög genomströmning Upptäckt av luftvägspatogener i Animal Prover av nano PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influensa A Virus studier på en musmodell av infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation av Escape varianter av neutraliserande influensa Virus monoklonala antikroppar

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snabb, säker och enkel manuell sängkanten nukleinsyra extraktion för påvisande av Virus i helblod

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...