Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

وأيد هذا البحث من خلال منحة R01NS062842 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية والمعاهد الوطنية للصحة (الليبرالي) ، ومنح R21 NS064403 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية والمعاهد الوطنية للصحة من خلال الأذربيجانية (الليبرالي) و R21 EB006301 المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية والمعاهد الوطنية للصحة (الليبرالي).

وينبغي أن تكون على استعداد للكشف عن أجزاء الجهاز المستندة الجزيئية أولا لأن إعدادها وقتا أكثر من تجميع الجهاز الجزيئي. وبناء يعمل بشكل جيد مع 5 أبواب 6μm سميكة من قطع بارافورمالدهيد الثابتة ، وكتل البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج. استخدام العلامات التجارية الشريحة ا?...

<ol>
	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines.">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li><li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+machines,+Maxwell's+demon+and+living+organisms.">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li><li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+as+a+molecular+machine.">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li><li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية تجميع واستخدام الحمض النووي الوسم المزدوج استشعار الضرر. المجس هو آلة جزيئية مدفوعا الحيوية الجزيئية المحرك ، وهو فيروس ترميز TOPO VACC البروتين المرتبط مع مكونات اصطناعية. وقدم مثالا على تطوير نهج الحيوي الذي مكن دعاة تكييف الهياكل البي...

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزيلين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإيثانول 80 و 96 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ٪ من محلول الزلال المصل البقري (BSA) في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قليل النوكليوتيد 1 : دبوس الشعر المزدوج ، المزدوج المسمى مع فلوريسئين وtetramethylrhodamine : </li></ol> 5&#39; - GC AAG GGA CCT F GCA GGT CCC ACG TTA CAT R في فريق التنسيق العالمي TT - 3 &#39;؛ F -- FITC - DT ؛ R -- Tetramethylrhodamine - DT. ويمكن استخدام غيرها الحمراء تحولت fluorophores مثل TR BODIPY ، رودامين أو طمره بدلا من tetramethylrhodamine كما R. بدلا من ذلك يمكنك استخدام قليل النوكليوتيد 2 -- واحد مزدوج مع دبوس الشعر المسمى فلوريسئين (للكشف عن نوع واحد من فواصل الحمض النووي (الدناز II - نوع فقط) التحقيق المفرد fluorophore الحاملة هو أقل كلفة بكثير ومريحة كلما واحد نوع من الحمض النووي هو كسر ليكون المسمى : 5&#39; - GC AAG GGA CCT F GCA GGT TTA CCC ACG CAT ATG CGT T - 3 &#39;؛ F -- FITC - DT </p&gt; <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قليل النوكليوتيد 3. كليلة العضوية رودامين المسمى القاسي لتعزيز الموقع في إشارة ربط مع الحمض النووي ليغاز T4 : فريق التنسيق العالمي 5&#39; - C R CTA GAC G GTC TAG CGC - 3 &#39;؛ R -- Tetramethylrhodamine - DT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوقس الحمض النووي ل topoisomerase (VACC TOPO) -- 3000 U / ميكروليتر (تكنولوجيا حية). في التجارب الأولية استخدمنا pmoles 215 (7.1 ميكروغرام) من TOPO VACC في كل ميكرولتر 25 من خليط التفاعل. ومع ذلك ، يمكن تركيز topoisomerase انخفاض كبير دون فقدان الحساسية. كنا في وقت لاحق على كمية أقل من أربع مرات TOPO VACC في المقطع (1.76 ميكروغرام في 25 ميكرولتر من مزيج التفاعل في القسم) مع نتائج مماثلة. تخفيض كمية انتاج الانزيم لنانوغرام 880 (في 25 ميكرولتر من مزيج التفاعل) أدى إلى ضعف و 8.8 نانوغرام إشارة من TOPO VACC أي إشارة يمكن كشفها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T4 DNA يغاز 5 U / ميكروليتر (روش). هذا التحضير يغاز مركزة للغاية ويعطي إشارة أفضل في ظروفنا التجريبية. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 x لتحديد رد فعل العازلة يغاز DNA T4 : 660 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 50 ملي MgCl 2 و 10 ملي dithioerythritol ، 10 ملي للاعبي التنس المحترفين ، ودرجة الحموضة 7.5 (20 درجة مئوية) (روش). يتم إتلاف بسهولة في بطولة العازلة رد فعل في دورات متكررة من تجميد لاذابة. قسامة المخزن المؤقت في أجزاء صغيرة ميكرولتر وتخزينها في 15-20 -- 20 درجة مئوية استخدام مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 ٪ (W / V) حل PEG - 8000 (سيغما) في الماء bidistilled. 15 ٪ PEG - 8000 في مزيج يحفز رد فعل قويا في الكشف ، وزيادة فعالية تركيزات مكوناته من جراء الاستبعاد وحدة التخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتين K (روش) 20 محلول المخزون ملغ / مل في الماء المقطر. المحل في -- 20 درجة مئوية وفي رد فعل الحل استخدام 50mg/mL في برنامج تلفزيوني ، أعدت من المخزون. لا إعادة استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vectashield مع دابي (ناقلات مختبرات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيكربونات الصوديوم العازلة : 50M NaHCO M 3 ، M 15M كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 22x22mm أو 22x40mm الزجاج أو البلاستيك coverslips. coverslips البلاستيكية هي الأفضل خلال رد فعل ، كما قامواإعادة لإزالة أسهل من هذا الباب. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

طبيعيا الحيوية الجزيئية آلات العمل في كل خلية حية وعرض مجموعة متنوعة من تصاميم 1-6. بعد تطوير مراكز صناعية آلات جزيئية على أجهزة قادرة على الحركة الاتجاه ، أي المحركات الجزيئية ، وعلى أجزاء مصغرة من الميكانيكية (العجلات ، الخ axels المعلقات ، و) 7-9. هذا يقلد آلات الكلي ، على الرغم من أن الخصائص الفيزيائية الأساسية لهذه الأجهزة ، مثل الجمود والحفاظ على الزخم ، ليست صالحة للاستعمال في البيئات nanoworld 10. ويمكن لتصاميم بديلة ، والتي لا تتبع مخططات macromachines الميكانيكية واستخدام الآليات المتقدمة في تطور الجزيئات البيولوجية ، والاستفادة من الشروط المحددة للnanoworld. الى جانب ذلك ، التكيف مع الجزيئات البيولوجية الفعلية لأغراض تصميم نانو يقلل المخاطر المحتملة لمنتجات تكنولوجيا النانو قد تشكل. نحن هنا لشرح التجمع وتطبيق واحد بناء الحيوية مكن من هذا القبيل ، كماEMI - الجزيئية الاصطناعية الجهاز الذي يجمع بين جهاز طبيعيا مع مكونات جزيئية اصطناعية. من وجهة نظر علم الإنزيمات ، وبناء لدينا هو مصمم الفلورسنت انزيم الركيزة المعقدة وضعت معا لأداء وظيفة محددة مفيدة. هذا التجمع هو تعريف الجهاز الجزيئي ، كما يحتوي على واحد 12. حتى الآن ، والتكامل مع الجزء هندسيا -- دبوس الشعر المزدوج فلوري -- إعادة توجهها إلى مهمة جديدة من الحمض النووي من التلف العلامات 12. بناء تجمع لدينا من أصل 32 - DNA مير وtopoisomerase الوقس أنا انزيم (VACC TOPO). الجهاز ثم يستخدم المواد الخاصة بها الى افتعال حدتين كاشف fluorescently المسمى (الشكل 1). واحدة من وحدات (مخضر) يحمل VACC TOPO المرفقة تساهميا ل3&#39;end وحدة أخرى (أحمر مضان) هو منعطف حاد الحرة مع 3&#39;OH المحطة. وحدات قصيرة الأجل ويحشدوا بسرعة مرة أخرى إلى بناء الأصلي ، الذي recleaves في وقت لاحق.في غياب الحمض النووي فواصل هاتين الوحدتين منفصلة religate باستمرار وبطريقة دورية. في أقسام الأنسجة مع الحمض النووي من التلف ، وحدة للكشف عن topoisomerase الحاملة تعلق الحمض النووي بشكل انتقائي للفواصل حادة مع 5&#39;OH العضوية (من النوع الثاني الدناز فواصل) 11،12 ، ووضع العلامات fluorescently لهم. الثانية ، انزيم خالية القاسي تشكلت بعد قليل النوكليوتيد الانقسام ، وسوف ligate لكسر 5&#39;PO كليلة العضوية 4 (I - الدناز نوع فواصل) 11،12 ، إذا T4 يغاز الحمض النووي موجود في حل 13،14. عند إضافة T4 يغاز الحمض النووي لقسم الأنسجة أو محلول يحتوي على الحمض النووي مع فواصل حادة العضوية 5&#39;PO 4 ، يغاز يتفاعل مع الحمض النووي تنتهي 5&#39;PO 4 ، وتشكيل شبه مستقرة انزيم الدنا المجمعات. سوف دبابيس الشعر كليلة العضوية تتفاعل مع هذه المجمعات الافراج يغاز دبابيس الشعر ، وربط تساهميا إلى الحمض النووي ، وبالتالي وضع العلامات 5&#39;PO 4 فواصل الحمض النووي كليلة العضوية. هذا التطور تجسد نهجا جديدا لعملية ال(ه) من تصميم الآلات الجزيئية ويوفر جهاز استشعار مفيدة للكشف عن الخلايا والحمض النووي الضرر في الخلايا والأنسجة الثابتة.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

نبدي التجمع وتطبيق جهاز الجزيئية النطاق مدعوم من البروتين topoisomerase. وبناء عبارة عن مستشعر الحيوية الجزيئية التي تصف نوعان رئيسيان من فواصل الحمض النووي في أقسام الأنسجة عن طريق ربط two fluorophores مختلفة لتحقيق غاياتهم.

الجمعية في المختبر من نصف اصطناعية آلة الجزيئية واستخدامها للكشف عن الحمض النووي من التلف

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

التوليف ، والجمعية ، وتوصيف أحادي الطبقة المحمية الجسيمات النانوية الذهبية للأفلام كهربية البروتين أحادي الطبقة

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

CometChip: إنتاجية عالية منصة 96-حسنا لقياس الحمض النووي من التلف في خلايا الإنسان Microarrayed

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

استخدام إنتاجية عالية<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعدد الأنواع عن طريق الفم

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

الآلي الجمعية معالجة السائل الروبوتية أجهزة وحدات الحمض النووي

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

توليف Cationized Magnetoferritin للمغنطة فائقة السرعة من الخلايا

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

بناء واستخدام دائرة التحفيز الكهربائي لتعزيز Osteogenic التمايز في الخلايا الجذعية الوسيطة/اللحمية في المختبر

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

الجسيمات الحيوية Microarrays للتحليل الكيميائي والجزيئي للالعدلة البشرية يحتشدون في المختبر

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...