Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af tilskud R01NS062842 fra National Institute of Neurological Disorders og slagtilfælde, National Institutes of Health (VVD) og af tilskud R21 NS064403 fra National Institute of Neurological Disorders og slagtilfælde, National Institutes of Health gennem arra (VVD) og R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging og Bioengineering, National Institutes of Health (VVD).

Afsnittene for den molekylære maskine-baseret detektion bør udarbejdes først, fordi deres forberedelse tager længere tid end den samling af den molekylære enhed. De konstruerer fungerer godt med 5-6μm tykke sektioner skæres fra paraformaldehyd-fast, paraffinindstøbt væv blokke. Brug slide mærker, som bevarer sektioner godt, som f.eks ProbeOn Plus opladet og precleaned slides (Fisher Scientific) eller lignende. Vi anbefaler først at bruge en væv med en velkendt mønster af DNA-skader, som indeholder både DNa...

<ol>
	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines.">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li><li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+machines,+Maxwell's+demon+and+living+organisms.">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li><li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+as+a+molecular+machine.">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li><li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

I denne video viser vi hvordan man samler og bruger en dual-mærkning af DNA-skader sensoren. Sensoren er en molekylær maskine, drevet af bio-molekylære motorer, en virus-kodet protein VACC TOPO forbundet med kunstige komponenter. Den præsenterede udvikling eksemplificerer en bio-aktiveret strategi, der går tilpasse biologiske strukturer, arkitekturer og faktiske dele og komponenter af celler til design af ikke-giftige molekylære skala enheder 12,15. Denne tilgang løser to problemer forbundet med in...

<ol><li> Xylen </li><li> 80 og 96% Ethanol. </li><li> 2% opløsning af bovin serum albumin (BSA) i destilleret vand. </li><li> Oligonukleotid 1: en dobbelt-hårnål, dobbelt mærket med fluorescein og tetramethylrhodamine: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA FTT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R på GCG TT-3 «F - FITC-dT, R - Tetramethylrhodamine-dT. Andre rød-forskudt fluorophores såsom BODIPY TR, rhodamine eller Tamra kan bruges i stedet for tetramethylrhodamine som R. Alternativt kan du bruge Oligonucleotid. 2 - en dobbelt-hårnål enkelt mærket med fluorescein (til påvisning af en enkelt type af DNA pauser (DNase II-type) Den fælles-fluoroforen-transporterer sonde er betydeligt billigere og er praktisk, når en enkelt type DNA-pause på er at være mærket: 5&#39;-AAG GGA FTT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 «F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleotid 3. Blunt-ended rhodamine-mærket hårnål til forbedring af in situ ligatur signal med T4 DNA ligase: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 &#39;, R - Tetramethylrhodamine-dT </li><li> Vaccinia DNA-topoisomerase l (VACC TOPO) - 3000 U / mikroliter (Vivid Technologies). I den indledende eksperimenter brugte vi 215 pmoles (7,1 mikrogram) i VACC TOPO per hver 25 μL af reaktionsblandingen. Dog kan topoisomerase-koncentrationen være betydeligt reduceret uden tab af følsomhed. Vi senere brugte en fire gange mindre mængde VACC TOPO pr sektion (1,76 mg i 25 μL af reaktionsblandingen per afsnit) med lignende resultater. Reducere mængden af ​​enzymet til 880 ng (i 25 μL af reaktionsblandingen) resulterede i en svagere signal og 8,8 ng VACC TOPO gav ingen påviselig signal. </li><li> T4 DNA ligase 5 U / mikroliter (Roche). Denne meget koncentrerede ligase forberedelse giver det bedste signal i vores eksperimentelle betingelser. </li&gt; <li> 10 x Reaktionsbufferen for T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP i Reaktionsbufferen er let ødelagt i gentagne cyklusser af tø-frost. Alikvot bufferen i små 15-20 μL portioner og opbevares ved - 20 ° C. Brug en gang. </li><li> 30% (w / v) opløsning af PEG-8000 (Sigma) i bidistilled vand. 15% PEG-8000 i reaktionsblandingen kraftigt stimulerer påvisning, hvilket øger den effektive koncentration af dens bestanddele i volumen udstødelse. </li><li> Proteinase K (Roche) 20 mg / ml stamopløsning i destilleret vand. Opbevares ved - 20 ° C. I reaktionen brug 50mg/ml løsning i PBS, tilberedt fra bestanden. Må ikke genbruges. </li><li> Vectashield med DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Natriumbicarbonat buffer: 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8,2. </li><li> 22x22mm eller 22x40mm glas eller plastik dækglas. Plastic dækglas er at foretrække under reaktionen, da de enre lettere at fjerne fra afsnittet. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Naturligt forekommende bio-molekylære maskiner arbejder i alle levende celler, og vise en lang række designs 1-6. Men udviklingen af kunstige molekylære maskiner centre på enheder i stand til retningsbestemt bevægelse, dvs molekylære motorer, og på deres nedskaleret mekaniske dele (hjul, aksler, vedhæng osv.) 7-9. Dette efterligner den makro-maskiner, selv om de fysiske egenskaber af afgørende betydning for disse enheder, såsom træghed og momentum bevarelse, der ikke kan benyttes i NanoWorld miljøer 10. Alternative designs, som ikke følger de mekaniske macromachines ordninger og anvendelse af instrumenter udviklet i udviklingen af ​​biologiske molekyler, kan drage fordel af de særlige betingelser for NanoWorld. Desuden tilpasser faktiske biologiske molekyler med henblik på nano-design reducerer potentielle farer de nanoteknologiske produkter kan indebære. Her vil vi demonstrere samling og anvendelse af en sådan bio-aktiverede konstruktion, somEMI-kunstige molekylære enhed, som kombinerer en naturligt forekommende molekylære maskine med kunstige komponenter. Fra Enzymologi synspunkt, er vores konstruere en designer fluorescerende enzym-substrat kompleks sat sammen for at udføre en bestemt nyttig funktion. Denne samling er per definition en molekylær maskine, da det indeholder en 12. Men dets integration med de konstruerede del - fluorescerende dobbelt hårnål - re-dirigerer den til en ny opgave med mærkning af DNA-skader 12. Vores konstruere samler ud af en 32-mer DNA og et enzym vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). Maskinen bruger derefter sit eget materiale til at fremstille to fluorescens-mærkede detektor enheder (figur 1). En af de enheder (grøn fluorescens) bærer VACC TOPO kovalent knyttet til sin 3&#39;end og en anden enhed (rød fluorescens) er en gratis hårnål med en terminal 3&#39;OH. Enhederne er kortvarige og hurtigt samle tilbage til den oprindelige konstruktion, der efterfølgende recleaves.I mangel af DNA brud disse to enheder kontinuerligt separate og religate i en cyklisk måde. I vævssnit med DNA-skader, topoisomerase-bærende detektoren selektivt tillægger stumpt-ended DNA bryder med 5&#39;OH (DNase II-typen pauser), 11,12, fluorescens mærkning dem. Den anden, enzym-fri hårnål dannet efter oligonukleotidet spaltning, vil ligate til en 5&#39;PO 4 stump-ended pause (DNase I-type pauser), 11,12, hvis T4 DNA ligase er til stede i opløsningen 13,14. Når T4 DNA ligase føjes til et væv sektion eller en opløsning, der indeholder DNA med 5&#39;PO 4 stumpe-ended pauser, de ligase reagerer med 5&#39;PO 4 DNA ender, danner semi-stabilt enzym-DNA komplekser. Den stumpe endte hårnåle vil interagere med disse komplekser slippe ligase og kovalent forbinder hårnåle til DNA, og dermed mærkning 5&#39;PO 4 stump-ended DNA pauser. Denne udvikling er et eksempel på en ny praktisk tilgang til the design af molekylære maskiner og giver et nyttigt sensor til påvisning af apoptose og DNA-skader i faste celler og væv.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Vi viser monteringen og anvendelsen af ​​en molekylær-skala-enhed drevet af en topoisomerase protein. Det begreb er en bio-molekylære sensor, som etiketter to store typer af DNA-brud i vævssnit ved at knytte to forskellige fluorophores til deres mål.

In vitro Montering af Semi-kunstige Molekylær Machine og dens anvendelse til påvisning af DNA-skader

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

CometChip: En Højkapacitetsforskning 96-Well platform til måling af DNA-skader i mikroarrayet humane celler

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Anvendelse af et High-throughput<em&gt; In vitro</em&gt; Mikrofluidsystem at udvikle Oral Multi-arter biofilm

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning og Samling af 3D mikrokar

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatiseret robot flydende håndtering forsamling af modulære DNA enheder

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Syntese af kationiseret Magnetoferritin for Ultrahurtig magnetisering Celler

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Konstruktion og brug af en elektrisk Stimulation kammer for at øge Osteogenic differentiering i mesenkymale stamceller/stromale celler In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikel mikroarrays til kemotaktisk og molekylær analyse af human neutrofil sværmer in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...