Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidie ​​R01NS062842 van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke, National Institutes of Health (VVD) en door subsidies R21 NS064403 van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke, National Institutes of Health door middel van ARRA (VVD) en R21 EB006301 Nationaal Instituut voor Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health (VVD).

De secties van de moleculaire machine-gebaseerde detectie moeten eerst worden opgesteld omdat de voorbereiding meer tijd kost dan de montage van de moleculaire apparaat. Het construct werkt goed met 5-6μm dikke secties gesneden uit paraformaldehyde-gefixeerde, in paraffine ingebed weefsel blokken. Gebruik slide merken die secties te behouden en, zoals ProbeOn Plus geladen en voorgereinigde dia&#39;s (Fisher Scientific) of iets dergelijks. We raden aan om het eerste gebruik van een weefsel met een bekende patroon van DN...

<ol>
	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines.">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li><li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+machines,+Maxwell's+demon+and+living+organisms.">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li><li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+as+a+molecular+machine.">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li><li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

In deze video laten we zien hoe in elkaar te zetten en gebruik maken van een dual-etikettering van DNA-schade sensor. De sensor is een moleculaire machine aangedreven door bio-moleculaire motor, een virus-gecodeerde eiwit VACC TOPO verbonden met kunstmatige componenten. De gepresenteerde ontwikkeling een voorbeeld van een bio-enabled aanpak die biologische structuren, architecturen en de werkelijke onderdelen en componenten van cellen advocaten aan te passen aan het ontwerp van niet-toxische moleculaire schaal apparaten...

<ol><li> Xyleen </li><li> 80 en 96% ethanol. </li><li> 2% oplossing van bovine serum albumine (BSA) in gedestilleerd water. </li><li> Oligonucleotide 1: een dubbel-haarspeld, dubbele gelabeld met fluoresceïne en tetramethylrodamine: </li></ol> 5&#39;-GGA AAG CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R AT GCG TT-3 &#39;; F - FITC-dT, R - tetramethylrodamine-dT. Andere rode verschoven fluoroforen zoals BODIPY TR, rhodamine of Tamra kan in plaats van tetramethylrodamine worden gebruikt als R. Als alternatief kunt u gebruik maken Oligonucleotide 2 -. Een dubbele haarspeld single gelabeld met fluoresceïne (voor detectie van een enkel type van DNA breuken (DNase II-type) De single-fluorofoor-probe die is aanzienlijk minder duur en is handig wanneer een enkele soort DNA-break is geëtiketteerd te worden: 5&#39;-GGA AAG CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleotide 3. Stompe rhodamine-gelabeld haarspeld voor de verbetering van de in situ ligatie signaal met T4 DNA-ligase: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 &#39;, R - tetramethylrodamine-dT </li><li> Vaccinia DNA-topoisomerase l (VACC TOPO) - 3000 U / ul (Levendig Technologies). In de eerste experimenten gebruikten we 215 pmol (7,1 pg) van de VACC TOPO per elke 25 pi van de reactie mix. Echter, de topoisomerase concentratie aanzienlijk worden verminderd zonder verlies van gevoeligheid. We later gebruik gemaakt van een vier keer kleinere hoeveelheid VACC TOPO per sectie (1,76 microgram in 25 pi van het reactiemengsel per sectie) met vergelijkbare resultaten. Het verminderen van hoeveelheid van het enzym tot 880 ng (in 25 pi van het reactiemengsel) resulteerde in een zwakker signaal en 8,8 ng van VACC TOPO leverde geen detecteerbaar signaal. </li><li> T4 DNA-ligase 5 U / pl (Roche). Deze zeer geconcentreerde ligase voorbereiding geeft het beste signaal in onze experimentele omstandigheden. </li&gt; <li> 10 x reactiebuffer voor T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP in reactie buffer wordt gemakkelijk vernietigd in zich herhalende cycli van ontdooien-invriezen. Aliquot de buffer in kleine porties 15-20 il en op te slaan bij - 20 ° C. een keer gebruiken. </li><li> 30% (w / v) oplossing van de PEG-8000 (Sigma) in dubbelgedestilleerd water. 15% PEG-8000 in het reactiemengsel stimuleert sterk de detectie, het verhogen van de effectieve concentratie van de bestanddelen in volume uitsluiting. </li><li> Proteinase K (Roche) 20 mg / ml stockoplossing in gedestilleerd water. Bewaren bij - 20 ° C. In de reactie te gebruiken 50mg/mL oplossing in PBS, bereid uit de voorraad. Geen hergebruik. </li><li> Vectashield met DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Natriumbicarbonaat buffer: 50 M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8,2. </li><li> 22x22mm of 22x40mm glas of plastic dekglaasjes. Plastic coverslips zijn te verkiezen tijdens de reactie, omdat ze eenre makkelijker te verwijderen uit de sectie. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Natuurlijk voorkomende bio-moleculaire machines het werk in elke levende cel en tonen een verscheidenheid van ontwerpen 1-6. Toch is de ontwikkeling van kunstmatige moleculaire machines richt zich op apparaten die in staat van directionele beweging, dat wil zeggen moleculaire motoren, en op hun verkleinde mechanische onderdelen (wielen, assen, hangers, enz.) 7-9. Dit imiteert de macro-machines, hoewel de fysische eigenschappen van essentieel belang voor deze apparaten, zoals de inertie en het behoud momentum, niet kunnen worden gebruikt in de nanowereld omgevingen 10. Alternatieve ontwerpen, die zich niet aan de mechanische macromachines schema&#39;s en maken gebruik van mechanismen ontwikkeld in de evolutie van biologische moleculen, kunnen profiteren van de specifieke omstandigheden van de nanowereld. Trouwens, de aanpassing van de werkelijke biologische moleculen voor de doeleinden van nano-ontwerp vermindert de potentiële gevaren van nanotechnologie producten kan opleveren. Hier laten we zien de montage en de toepassing van een dergelijke bio-enabled te bouwen, zoalsemi-kunstmatige moleculaire apparaat dat een natuurlijk voorkomende moleculaire machine combineert met kunstmatige componenten. Vanuit het enzymologie oogpunt onze construct is een designer fluorescent enzyme-substraat complex in elkaar gezet om een ​​specifieke nuttige functie uit te voeren. Deze montage is per definitie een moleculaire machine, want het bevat een 12. Toch, de integratie met de kunstmatige gedeelte - TL dual haarspeldbochten - opnieuw leidt het naar een nieuwe taak voor de etikettering DNA-schade 12. Onze bouwen assembleert uit een 32-mer DNA en een enzym topoisomerase I vaccinia (VACC TOPO). De machine maakt gebruik van dan zijn eigen materiaal te fabriceren twee fluorescent gelabelde detector eenheden (figuur 1). Een van de eenheden (groene fluorescentie) draagt ​​VACC TOPO covalent gebonden aan de 3 &#39;uiteinde en een andere unit (rode fluorescentie) is een gratis haarspeld met een terminale 3&#39;OH. De units zijn van korte duur en al snel weer opnieuw samen in de originele constructie, die vervolgens recleaves.Bij het ontbreken van DNA breuken deze twee eenheden continu scheiden en religate op een cyclische manier. In weefsel secties met DNA-schade, de topoisomerase-dragende detector unit selectief hecht aan stompe DNA breekt met 5&#39;OH (DNase II-type breaks) 11,12, fluorescent te labelen. De tweede, enzym-vrij hairpin gevormd na oligonucleotide splitsing, zal ligeren aan een 5&#39;PO 4 stompe break (DNase I-type breaks) 11,12, als T4 DNA-ligase is in de oplossing aanwezig 13,14. Bij de T4 DNA-ligase wordt toegevoegd aan een tissue sectie of een oplossing met DNA met 5&#39;PO 4 stompe pauzes, de ligase reageert met 5&#39;PO vier DNA-uiteinden, de vorming van semi-stabiele enzym DNA-complexen. De stompe eindigde haarspeldbochten zullen omgaan met deze complexen het vrijgeven van ligase en covalent koppelen van haarspelden aan DNA, waardoor de etikettering 5&#39;PO 4 stompe DNA-breuken. Deze ontwikkeling is een voorbeeld van een nieuwe praktische benadering van ee ontwerp van moleculaire machines en biedt een nuttig sensor voor detectie van apoptose en DNA-schade in vaste cellen en weefsels.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Tonen we de montage en de toepassing van een moleculaire schaal apparaat aangedreven door een topoisomerase eiwit. Het construct is een bio-moleculaire sensor die twee belangrijke soorten van DNA breuken in weefselcoupes labels door het aanbrengen van twee verschillende fluoroforen om hun doel.

In vitro Vergadering van Semi-kunstmatige moleculaire machine en het gebruik ervan voor de detectie van DNA-schade

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthese, Vergadering, en de karakterisatie van monolaag Protected gouden nanodeeltjes Films voor eiwit monolaag Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

CometChip: Een High-throughput 96-Well Platform voor het meten van DNA-schade in Microarrayed menselijke cellen

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Toepassing van een High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning en montage van 3D microvaten

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Synthese van gekationiseerde Magnetoferritin voor ultrasnelle magnetisatie van Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Bioparticle Microarrays voor Chemotactic en Moleculaire Analyse van menselijke Neutrofiele Zwermen in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...