Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

Cette recherche a été financée par la subvention R01NS062842 de l&#39;Institut national des troubles neurologiques et les accidents cérébrovasculaires, National Institutes of Health (VVD) et par des subventions R21 NS064403 de l&#39;Institut national des troubles neurologiques et les accidents cérébrovasculaires, National Institutes of Health à l&#39;ARRA (VVD) et R21 EB006301 Institut national d&#39;imagerie biomédicale et bio-ingénierie, National Institutes of Health (VVD).

Les sections de la machine moléculaire basé sur la détection devrait être préparée d&#39;abord parce que leur préparation prend plus de temps que le montage du dispositif moléculaire. La construction fonctionne bien avec le 5-6 microns d&#39;épaisseur pans coupés du paraformaldéhyde-fixes, des blocs de tissus inclus en paraffine. Utiliser les marques diapositives qui conservent des sections bien, comme ProbeOn plus diapositives chargées et préalablement nettoyées (Fisher Scientific) ou similaire. Nous reco...

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	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. 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M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons comment assembler et à utiliser un capteur à double marquage de l&#39;ADN des dommages. Le capteur est une machine moléculaire tirée par la bio-moléculaires moteur, un virus protéine codée VACC TOPO liés à des composants artificiels. Le développement a présenté illustre une approche bio-permis qui prône l&#39;adaptation des structures biologiques, des architectures et des pièces réelles et des composants de cellules à la conception des dispositifs de non-toxique à l&#...

<ol><li> Xylène </li><li> 80 et 96% d&#39;éthanol. </li><li> Solution à 2% d&#39;albumine sérique bovine (BSA) dans l&#39;eau distillée. </li><li> Oligonucleotide 1: une épingle double, double marqués à la fluorescéine et tétraméthylrhodamine: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R AT GCG TT-3 &#39;; F - FITC-dT, R - tétraméthylrhodamine-dT. Autres décalée vers le rouge des fluorophores tels que BODIPY TR, la rhodamine ou TAMRA peut être utilisé au lieu de tétraméthylrhodamine que R. Sinon, vous pouvez utiliser deux oligonucléotides. - Un simple double-épingle marqués à la fluorescéine (pour la détection d&#39;un seul type de cassures de l&#39;ADN (DNase II de type seulement) La sonde unique fluorophore comptable est nettement moins cher et c&#39;est très pratique quand une seule type de cassure de l&#39;ADN doit être étiqueté: 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucléotide 3. Blunt-clos marqué à la rhodamine en épingle à cheveux pour l&#39;amélioration du signal de la ligature en place avec l&#39;ADN ligase T4: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 &#39;; R - tétraméthylrhodamine-dT </li><li> Vaccinia ADN topoisomérase l (VACC TOPO) - 3000 U / uL (Technologies Vivid). Dans les expériences initiales, nous avons utilisé 215 pmoles (7,1 ug) de l&#39;TOPO VACC par tous les uL 25 du mélange de réaction. Toutefois, la concentration topoisomérase peuvent être considérablement réduits sans perte de sensibilité. Nous avons ensuite utilisé une quantité quatre fois moindre de VACC TOPO par section (1,76 g dans 25 uL du mélange réactionnel par section) avec des résultats similaires. Réduire le montant de l&#39;enzyme à 880 ng (dans 25 uL du mélange de réaction) ont abouti à un signal plus faible et de 8,8 ng d&#39;VACC TOPO produit aucun signal détectable. </li><li> T4 ADN ligase 5 U / uL (Roche). Cette préparation très concentrée ligase donne le meilleur signal dans nos conditions expérimentales. </li&gt; <li> 10 x tampon de réaction de l&#39;ADN ligase T4: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 dithioérythritol mM, 10 mM d&#39;ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP dans un tampon de réaction est facilement détruite dans des cycles répétitifs de dégel-gel. Aliquoter le tampon dans de petites portions de 15 à 20 uL et stocker à - 20 ° C. Utiliser une seule fois. </li><li> 30% (p / v) de PEG-8000 (Sigma) dans l&#39;eau bidistillée. 15% de PEG-8000 dans le mélange réactionnel stimule fortement la détection, l&#39;augmentation des concentrations efficaces de ses constituants par l&#39;exclusion du volume. </li><li> Protéinase K (Roche) 20 solution stock mg / mL dans de l&#39;eau distillée. Entreposer à - 20 ° C. Dans la solution d&#39;utilisation de réaction 50mg/ml dans du PBS, préparé à partir du stock. Ne pas réutiliser. </li><li> Vectashield au DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Tampon bicarbonate de sodium: 50 M de NaHCO 3, 15m M de NaCl, pH 8,2. </li><li> De verre 22x22mm ou 22x40mm ou de lamelles de plastique. Lamelles en plastique sont préférables lors de la réaction, comme ils unere plus facile à enlever de la section. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Naturelle bio-moléculaire des machines de travail dans chaque cellule vivante et d&#39;afficher une variété de modèles 1-6. Pourtant, le développement de centres de machines moléculaires artificielles sur des appareils capables de mouvement directionnel, c&#39;est à dire les moteurs moléculaires, et sur ​​leur échelle réduite des pièces mécaniques (roues, essieux, etc pendentifs) 7-9. Cette imite les machines macro-, même si les propriétés physiques essentielles pour ces appareils, tels que l&#39;inertie et la conservation du moment, ne sont pas utilisables dans les environnements nanomonde 10. Conceptions alternatives, qui ne suivent pas les schémas mécaniques macromachines et utiliser des mécanismes développés dans l&#39;évolution des molécules biologiques, peuvent profiter des conditions spécifiques du nanomonde. Par ailleurs, l&#39;adaptation réelle des molécules biologiques aux fins de la nano-conception permet de réduire les dangers potentiels des produits des nanotechnologies peuvent présenter. Ici nous démontrons l&#39;assemblage et l&#39;application d&#39;une telle bio-permis de construire, commeemi-artificiel appareil moléculaire, qui associe une machine naturelle moléculaire avec des composants artificiels. Du point de vue de l&#39;enzymologie, notre construction est un concepteur fluorescents complexes enzyme-substrat mis ensemble pour remplir une fonction spécifique utile. Cet ensemble est par définition une machine moléculaire, car il contient un 12. Pourtant, son intégration avec la partie ingénierie - fluorescentes épingle double - le re-dirige vers une nouvelle tâche d&#39;étiquetage 12 dommages à l&#39;ADN. Notre construire assemble d&#39;un ADN de 32-mer et d&#39;une enzyme topoisomérase I vaccine (VACC TOPO). La machine utilise alors son propre matériel pour fabriquer deux unités de détection marqués par fluorescence (figure 1). L&#39;une des unités (fluorescence verte) effectue VACC TOPO covalente à son extrémité 3 &#39;et une autre unité (fluorescence rouge) est une épingle à cheveux libres avec un 3&#39;OH terminal. Les unités sont de courte durée et rapidement montés de nouveau dans la construction d&#39;origine, qui recleaves ultérieurement.En l&#39;absence d&#39;ADN pauses ces deux unités séparées en continu et religate de façon cyclique. Dans des coupes de tissus avec des dommages à l&#39;ADN, l&#39;unité de détecteur de topoisomérase porteurs attache sélective aux cassures de l&#39;ADN à bouts francs avec 5&#39;OH (DNase II de type casse) 11,12, fluorescence leur étiquetage. La seconde, sans enzyme épingle formé après clivage oligonucléotidique, sera ligaturer à un 5&#39;PO 4 à extrémité franche rupture (DNase I type pauses) 11,12, si l&#39;ADN ligase T4 est présent dans la solution 13,14. Lorsque l&#39;ADN ligase T4 est ajouté à une coupe de tissu ou d&#39;une solution contenant de l&#39;ADN avec des 5&#39;PO 4 bouts francs pauses, la ligase réagit avec 5&#39;PO 4 extrémités d&#39;ADN, formant semi-stable enzyme-ADN. Les épingles à bouts francs vont interagir avec ces complexes libérant épingles ligase et lier de façon covalente à l&#39;ADN, ce qui étiquetage 5&#39;PO 4 cassures de l&#39;ADN à bouts francs. Ce développement illustre une nouvelle approche pratique pour ela conception électronique de machines moléculaires et offre un capteur utile pour la détection de l&#39;apoptose et endommagent l&#39;ADN dans les cellules et les tissus fixes.

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Nous démontrons l&#39;assemblage et l&#39;application d&#39;un dispositif à l&#39;échelle moléculaire alimenté par une protéine topoisomérase. La construction est un capteur bio-moléculaires dont les étiquettes deux grands types de cassures de l&#39;ADN dans les coupes de tissus en attachant deux fluorophores différents à leurs extrémités.

Assemblage in vitro de la semi-artificielle machine moléculaire et son utilisation pour la détection de lésions de l&#39;ADN

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Recherche

Bio-ingénierie

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Synthèse, l&#39;Assemblée, et caractérisation des nanoparticules Monocouche protégées Films d&#39;or pour Electrochimie monocouche de protéines

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

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DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

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