Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Grant R01NS062842 vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health (VVD) und durch Zuschüsse R21 NS064403 vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health durch ARRA (VVD) und R21 unterstützt EB006301 National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health (VVD).

Die Abschnitte für die molekulare Maschine-basierte Erkennung sollten zunächst vorbereitet werden, weil ihre Vorbereitung nimmt mehr Zeit als die Montage der molekularen Gerät. Das Konstrukt funktioniert gut mit 5-6μm dicke Abschnitte aus Paraformaldehyd-fixierte, in Paraffin eingebettetes Gewebe Blöcke geschnitten. Verwenden Sie schieben Marken, die Abschnitte zu halten und, wie ProbeOn Plus-geladen und vorgereinigte Objektträger (Fisher Scientific) oder ähnliches. Wir empfehlen zunächst mit einem Gewebe mit ei...

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	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. 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In diesem Video zeigen wir, wie zu montieren und ein Dual-Kennzeichnung DNA-Schäden Sensor. Der Sensor ist eine molekulare Maschine durch bio-molekularen Motor, ein Virus-kodierte Protein VACC TOPO mit künstlichen Komponenten verbunden angetrieben. Die vorgestellte Entwicklung beispielhaft für eine bio-fähigen Ansatz, der die Anpassung biologischer Strukturen, Architekturen und tatsächlichen Teile und Komponenten von Zellen Fürsprecher der Gestaltung von ungiftigen molekularen Skala Geräte 12,15. Diese...

<ol><li> Xylol </li><li> 80 und 96% Ethanol. </li><li> 2% ige Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) in destilliertem Wasser. </li><li> Oligonukleotid 1: Doppel-Haarnadel, dual mit Fluorescein und Tetramethylrhodamin gekennzeichnet: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R AT GCG TT-3 &#39;; F - FITC-dT; R - Tetramethylrhodamine-dT. Andere rotverschoben Fluorophore wie BODIPY TR, Rhodamin oder TAMRA kann anstelle von Tetramethylrhodamin als R verwendet werden. Alternativ können Sie Oligonukleotid 2 -. Doppel-Haarnadel Einzelzimmer mit Fluorescein (für den Nachweis von einer einzigen Art von DNA-Brüchen (DNase II-Typ) Die Einzel-Fluorophor-tragenden Sonde ist wesentlich billiger und ist praktisch, wenn ein einzelnes Art der DNA brechen, um zu kennzeichnen: 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleotid 3. Blunt-ended rhodaminmarkierten Haarnadel für die Verbesserung der in-situ-Ligation Signal mit T4 DNA-Ligase: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 &#39;; R - Tetramethylrhodamine-dT </li><li> Vaccinia DNA Topoisomerase l (VACC TOPO) - 3000 U / ul (Vivid Technologies). In den ersten Versuchen verwendeten wir 215 pmol (7,1 ug) der VACC TOPO pro jede 25 ul des Reaktionsgemisches. Allerdings kann die Topoisomerase-Konzentration deutlich, ohne den Verlust der Empfindlichkeit reduziert werden. Wir haben später benutzte eine viermal geringere Menge an VACC TOPO pro Abschnitt (1,76 mg in 25 ul der Reaktionsmischung pro Abschnitt) mit ähnlichen Ergebnissen. Reduzierung der Menge des Enzyms bis 880 ng (in 25 ul der Reaktion mix) führte ein schwächeres Signal und 8,8 ng VACC TOPO produziert keine nachweisbaren Signal. </li><li> T4 DNA-Ligase 5 U / ul (Roche). Dieses hochkonzentrierte Ligase Vorbereitung gibt das beste Signal in unseren experimentellen Bedingungen. </li&gt; <li> 10 x Reaktionspuffer für T4 DNA-Ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 mM Dithioerythrit, 10 mM ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP in Reaktionspuffer ist einfach in sich wiederholenden Zyklen Auftauen Einfrieren zerstört. Aliquot der Puffer in kleinen 15-20 ul Portionen und bei - 20 ° C einmal verwenden. </li><li> 30% (w / v) Lösung von PEG-8000 (Sigma) in zweifach destilliertem Wasser. 15% PEG-8000 in der Reaktionsmischung stark stimuliert die Erkennung, die Erhöhung der effektiven Konzentrationen der Bestandteile Vol. Ausgrenzung. </li><li> Proteinase K (Roche) 20 mg / ml Stammlösung in destilliertem Wasser. Lagerung bei - 20 ° C. Bei der Reaktion verwenden 50mg/ml Lösung in PBS, aus dem Lager vorbereitet. Dürfen nicht wiederverwendet werden. </li><li> Vectashield mit DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Natriumbicarbonatpuffer: 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8,2. </li><li> 22x22mm oder 22x40mm Glas oder Kunststoff Deckgläser. Plastic Deckgläser sind während der Reaktion vorzuziehen, da sie einere leichter aus dem Abschnitt zu entfernen. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Natürlich vorkommende bio-molekulare Maschinen arbeiten in jeder lebenden Zelle und zeigt eine Vielzahl von Designs 1-6. Doch die Entwicklung von künstlichen molekularen Maschinen konzentriert sich auf Geräte, die gerichtete Bewegung, dh molekularen Motoren, und auf deren abgespeckte mechanische Teile (Räder, Achsen, Anhänger usw.) 7-9. Dies ahmt die Makro-Maschinen, auch wenn die physikalischen Eigenschaften essentiell für diese Geräte, wie Trägheit und Impulserhaltung, nicht verwendbar sind in der Nanowelt Umgebungen 10. Alternative Entwürfe, die sich nicht an die mechanische macromachines Systeme und Einsatz von Mechanismen in der Evolution von biologischen Molekülen entwickelt, können die Vorteile der spezifischen Bedingungen der Nanowelt zu nehmen. Außerdem Anpassung tatsächlichen biologischen Molekülen für die Zwecke der Nano-Design reduziert mögliche Gefahren der Nanotechnologie-Produkte darstellen können. Hier zeigen wir die Montage und Anwendung eines solchen Bio-fähigen konstruieren, wieemi-künstlichen molekularen Gerät, das ein natürlich vorkommendes molekulare Maschine kombiniert mit künstlichen Komponenten. Von der Enzymologie Sicht ist unser Bau eines Designer-Fluoreszenz-Enzym-Substrat-Komplex zusammen, um eine bestimmte nützliche Funktion zu erfüllen. Diese Versammlung ist per Definition eine molekulare Maschine, wie es ein 12 enthält. Doch die Integration mit dem entwickelten Teil - leitet wieder an eine neue Aufgabe, Kennzeichnung DNA-Schäden 12 - Leuchtstofflampen zwei Haarnadel. Unsere Konstruktion montiert aus einem 32-mer DNA und ein Enzym Vaccinia-Topoisomerase I (VACC TOPO). Die Maschine nutzt dann sein eigenes Material zu zwei fluoreszenzmarkierten Detektor-Einheiten (Abbildung 1) zu fertigen. Eine der Einheiten (grüne Fluoreszenz) führt VACC TOPO kovalent an seiner 3&#39;-Ende und eine andere Einheit (rote Fluoreszenz) befestigt ist ein kostenloser Haarnadel mit einem Terminal 3&#39;OH. Die Geräte sind kurzlebig und schnell wieder zusammenbauen in den ursprünglichen Bau, der anschließend recleaves.In Abwesenheit von DNA-Brüchen dieser beiden Einheiten kontinuierlich zu trennen und religate in zyklischer Weise. In Gewebeschnitten mit DNA-Schäden, die Topoisomerase-tragenden Detektoreinheit selektiv beimisst blunt-ended DNA-Brüchen mit 5&#39;OH (DNase II-Typ Pausen) 11,12, Fluoreszenzmarkierung sie. Das zweite Enzym-freien Haarnadel nach Oligonukleotid-Spaltung gebildet wird, eine 5&#39;PO 4 blunt-ended break (DNase I-Typ Pausen) 11,12 ligieren, wenn T4 DNA-Ligase ist in der Lösung vorhanden 13,14. Wenn T4 DNA-Ligase zu einem Gewebeschnitt oder einer Lösung mit DNA mit 5&#39;PO 4 blunt-ended Pausen hinzugefügt wird, reagiert der Ligase mit 5&#39;PO 4 DNA Enden, bilden semi-stabilen Enzym-DNA-Komplexe. Die stumpfen Enden Haarnadeln wird mit diesen Komplexen freigesetzt Ligase und kovalente Verknüpfung Haarnadeln, um DNA interagieren, damit die Kennzeichnung 5&#39;PO 4 blunt-ended DNA-Brüche. Diese Entwicklung verdeutlicht eine neue praktische Annäherung an the-Design von molekularen Maschinen und bietet einen nützlichen Sensor zur Detektion von Apoptose und DNA-Schäden in fixierten Zellen und Geweben.

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Wir zeigen die Montage und Anwendung eines molekularen Maßstab Gerät durch eine Topoisomerase Protein versorgt. Das Konstrukt ist ein bio-molekularen Sensor, der im Wesentlichen zwei Arten von DNA-Brüchen in Gewebeschnitten Etiketten durch Anbringen von zwei unterschiedlichen Fluorophoren an ihren Enden.

In-vitro-Assembly von Semi-künstliche molekulare Maschine und ihre Verwendung zum Nachweis von DNA-Schäden

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

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Biotechnik

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Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

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DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

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Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

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