Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי מענק R01NS062842 מן המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים הלאומיים לבריאות (VVD) וכן על ידי מענקים R21 NS064403 מן המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות ערה (VVD) ו R21 EB006301 המכון הלאומי ביו הדמיה Bioengineering, המכונים הלאומיים לבריאות (VVD).

סעיפים לאיתור מכונת מבוססי מולקולרית צריכים להיות מוכנים הראשון, כי ההכנה שלהם לוקח זמן רב יותר מאשר ההרכבה של המכשיר מולקולרית. לבנות עובד גם עם 5-6μm בעובי לחתוך קטעים מתוך paraformaldehyde-קבוע, פרפין, משובצים אבני רקמות. השתמש המותגים שקופיות אשר שומרים על החלקים היטב, כגו?...

<ol>
	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines.">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li><li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+machines,+Maxwell's+demon+and+living+organisms.">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li><li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+as+a+molecular+machine.">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li><li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

בסרטון הזה, אנו מראים כיצד להרכיב ולהשתמש כפול תיוג DNA חיישן נזק. החיישן הוא מכונה מולקולרית מונע על ידי מנוע ביו מולקולרית, וירוס המקודד חלבון VACC Topo מקושר עם מרכיבים מלאכותיים. הפיתוח המוצג מדגים גישה ביו מופעלת הדוגלת בהתאמת מבנים ביולוגיים, ארכיטקטורות בפועל חלקים...

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קסילן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80 ו - 96% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2% אלבומין בסרום שור (BSA) במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligonucleotide 1: סיכת ראש כפולה, כפולה עם שכותרתו והעמסת ו tetramethylrhodamine: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC tta ACG CAT R AT מהפקולטה לרוקחות אוכלים TT-3 &quot;; F - FITC-DT; R - Tetramethylrhodamine-DT. אחרים אדום העביר fluorophores כגון BODIPY TR, rhodamine או טמרה יכול לשמש במקום tetramethylrhodamine כמו R. לחילופין אתה יכול להשתמש 2 oligonucleotide -. בודדת מכבנה פעמיים שכותרתו עם והעמסת (לצורך זיהוי של סוג אחד של הפסקות DNA (DNase מסוג II בלבד) בדיקה חד fluorophore נושאי משמעותית פחות יקר נוח בכל אחת סוג לשבור DNA היא להיות מתויג: 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC tta ACG CAT ATG CGT T-3 &quot;; F - FITC-DT </p&gt; <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligonucleotide 3. בלאנט, הסתיים rhodamine שכותרתו מכבנה להגברת האות של קשירת באתרו עם האנזים T4 DNA: 5&#39;-CTA מהפקולטה לרוקחות אוכלים GAC C R G GTC TAG CGC-3 &quot;; R - Tetramethylrhodamine-DT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC Topo) - 3000 U / μL (טכנולוגיות Vivid). בניסויים הראשונים השתמשנו pmoles 215 (7.1 מיקרוגרם) של Topo VACC לכל μL 25 כל תמהיל התגובה. עם זאת, ריכוז topoisomerase ניתן לצמצם באופן משמעותי ללא איבוד של רגישות. אנחנו אחר כך השתמשו בכמות פחותה של ארבע פעמים VACC Topo לכל סעיף (1.76 מיקרוגרם ב μL 25 של תערובת התגובה לכל סעיף) עם תוצאות דומות. צמצום כמות האנזים עד 880 ננוגרם (ב μL 25 של תערובת התגובה) הביא אות חלש של 8.8 ננוגרם VACC Topo הפיק שום אות לזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T4 DNA האנזים 5 U / μL (Roche). זו הכנה האנזים מרוכז מאוד ונותן את האות הטוב ביותר בתנאי הניסוי שלנו. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 x חיץ תגובה עבור האנזים T4 DNA: 660 mM טריס-HCl, 50 מ&quot;מ MgCl 2, dithioerythritol 10 מ&quot;מ, 10 mM ATP, ה-pH 7.5 (20 ° C) (Roche). ATP במאגר התגובה הוא נהרס בקלות במחזורים חוזרים של הפשרה, הקפאה. Aliquot חיץ מנות קטנות μL 15-20 ולאחסן ב - 20 ° C. השתמש פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30% (w / v) פתרון של PEG-8000 (Sigma) במים bidistilled. 15% PEG-8000 בתמהיל תגובה מאוד מגרה את זיהוי, להגדיל את ריכוזי יעיל של המרכיבים שלה על ידי הרחקה נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Proteinase K (Roche) 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מניות פתרון במים מזוקקים. חנות ב - 20 ° C. בשנת פתרון התגובה 50mg/mL להשתמש ב-PBS, מוכנים מהמלאי. אל חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vectashield עם DAPI (וקטור מעבדות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביקרבונט חיץ נתרן: 50 מ &#39;NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית 22x22mm או 22x40mm או coverslips פלסטיק. Coverslips פלסטיק עדיפים במהלך התגובה, כפי שהםמחדש קל להסיר הסעיף. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

באופן טבעי ביו מולקולרית מכונות לעבוד בכל תא חי להציג מגוון של עיצובים 1-6. עם זאת, פיתוח של מכונות מולקולריות מרכזי מלאכותי על מכשירים המסוגלים תנועה כיוונית, כלומר מנועים מולקולריים, ועל חלקים מוקטנת שלהם מכני (גלגלים, axels, תליונים וכו &#39;) 7-9. זה מחקה את המאקרו מכונות, למרות התכונות הפיסיקליות חיוני עבור התקנים אלה, כגון אינרציה ושימור תנע, לא שמיש בסביבות nanoworld 10. עיצובים חלופיים, אשר לא פעל תוכניות מכני macromachines ולהשתמש במנגנוני התפתח באבולוציה של מולקולות ביולוגיות, יכולים לנצל את התנאים הספציפיים של nanoworld. חוץ מזה, התאמת מולקולות ביולוגיות בפועל למטרות ננו עיצוב מפחית הסכנות הטמונות במוצרים ננוטכנולוגיה עשויה להוות. כאן אנו מדגימים את הרכבה ואת היישום של לבנות חיים ביו אפשרה כאלה, כמואמי-מלאכותי התקן מולקולרי המשלבת מכונה מולקולרית טבעיים המתחוללים עם מרכיבים מלאכותיים. מנקודת מבט enzymology, לבנות שלנו הוא מעצב פלורסנט אנזימים המצע מורכב להרכיב לבצע פונקציה שימושית ספציפית. הרכבה זו מעצם הגדרתה מכונה מולקולרית, כפי שהוא מכיל 12. עם זאת, השילוב שלו עם החלק מהונדסים - סיכת ראש כפול פלורסנט - מחדש מכוון שזה משימה חדשה של תיוג נזק לדנ&quot;א 12. לבנות שלנו מרכיב מתוך ה-DNA 32-mer ו אנזים vaccinia topoisomerase אני (VACC Topo). המכונה ואז משתמש בתוכן משלה לפברק שתי יחידות גלאי שכותרתו fluorescently (איור 1). אחת היחידות (פלואורסצנטי ירוק) נושא VACC Topo מחוברת קוולנטית אל 3&#39;end שלה ליחידה אחרת (אדום פלואורסצנטי) היא סיכת חינם עם 3&#39;OH סופנית. היחידות קצרת ובמהירות מחדש בחזרה לבנות המקורי, אשר לאחר מכן recleaves.בהעדר DNA הפסקות אלו שתי יחידות נפרדות ברציפות religate בצורה מחזורית. בקטעים רקמה עם נזק לדנ&quot;א, יחידת topoisomerase נושאי גלאי סלקטיבי מייחסת בוטה, שהסתיימה עם הפסקות DNA 5&#39;OH (DNase II מסוג הפסקות) 11,12, fluorescently תיוג אותם. השני, אנזים ללא מכבנה נוצר לאחר מחשוף oligonucleotide, יהיה ולקשור את הפסקה 5&#39;PO בוטה, הסתיים 4 (DNase אני מסוג הפסקות) 11,12, אם האנזים T4 DNA נמצא הפתרון 13,14. כאשר האנזים T4 DNA הוא הוסיף קטע רקמה או פתרון המכילים DNA עם 5&#39;PO 4 קהה הסתיים הפסקות, האנזים מגיב עם 5&#39;PO 4 קצוות DNA, ויצרו חצי יציב אנזים-DNA קומפלקסים. סיכות הסתיים בוטה יקיימו אינטראקציה עם אלה מתחמי שחרור האנזים סיכות ו קוולנטית קישור ל-DNA, ובכך תיוג 5&#39;PO 4 בוטה-DNA הסתיימו הפסקות. פיתוח זה מדגים גישה מעשית חדשה העיצוב דואר של מכונות מולקולריות ומספק חיישן שימושי עבור זיהוי של אפופטוזיס ו-DNA נזק בתאים וברקמות קבוע.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

אנו מדגימים את הרכבה ואת היישום של התקן מולקולרי בקנה מידה מופעל על ידי חלבון topoisomerase. לבנות הוא חיישן ביולוגי מולקולרי אשר תוויות שני סוגים עיקריים של הפסקות DNA בסעיפים רקמה על ידי מצרפת שניים fluorophores שונים למטרותיהם.

בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ&quot;א

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

סינתזה, הרכבה, אפיון monolayer מוגן סרטים Nanoparticle זהב עבור אלקטרוכימיה monolayer חלבון

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

ביו-מאמר מיקרומערכים למיקרוטקטיקה וניתוח מולקולרי של נויטרופילים אנושיים

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...