Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
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इस शोध R01NS062842 अनुदान द्वारा मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान और स्ट्रोक, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (VVD) से और स्नायविक विकारों और स्ट्रोक ARRA के माध्यम से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (VVD) और R21 के राष्ट्रीय संस्थान से NS064403 R21 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया EB006301 बायोमेडिकल इमेजिंग और बायोइन्जिनियरिंग के राष्ट्रीय संस्थान, स्वास्थ्य (VVD) के राष्ट्रीय संस्थानों.

मशीन आधारित आणविक पता लगाने के लिए वर्गों पहले तैयार किया जाना चाहिए क्योंकि उनकी तैयारी आणविक डिवाइस के विधानसभा से अधिक समय लेता है. का निर्माण 5-6μm मोटी paraformaldehyde तय, आयल एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक से काट वर्गों ?...

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	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. 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इस वीडियो में, हम का प्रदर्शन कैसे इकट्ठा और एक लेबलिंग दोहरी डीएनए की क्षति सेंसर का उपयोग करें. सेंसर एक आणविक जैव आणविक इंजन, एक प्रोटीन वायरस इनकोडिंग Vacc कृत्रिम घटकों के साथ जुड़ा हुआ Topo द्वारा संचा?...

<ol><li> Xylene </li><li> 80 और 96% इथेनॉल. </li><li> आसुत जल में गोजातीय सीरम albumin (BSA) के 2% समाधान. </li><li> Oligonucleotide 1: एक डबल बाल के लिये कांटा, दोहरी fluorescein और tetramethylrhodamine के साथ लेबल: </li></ol> 5&#39;-आग GGA CCT जीसी एफ GCA GGT सीसीसी TTA ACG कैट GCG एटी आर टीटी-3 &#39;; F-FITC-dt; आर - Tetramethylrhodamine-dt. BODIPY टी.आर., rhodamine या Tamra जैसे अन्य लाल स्थानांतरित fluorophores आर के रूप में किया जा tetramethylrhodamine के बजाय प्रयोग किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से आप 2 Oligonucleotide का उपयोग कर सकते हैं - एक डबल बाल के लिये कांटा fluorescein के साथ लेबल एकल (डीएनए को तोड़ता है (DNase-II प्रकार केवल) का एक प्रकार का पता लगाने के के लिए एकल fluorophore ले जाने जांच काफी कम खर्चीला है और सुविधाजनक है एक एकल जब भी डीएनए को तोड़ने के प्रकार लेबल किया जा रहा है: 5&#39;-आग CCT जीसी एफ GCA GGT सीसीसी TTA ACG कैट ATG CGT GGA T-3 &#39;, एफ - FITC- dt </p&gt; <ol start="5"><li> 3 Oligonucleotide. Tetramethylrhodamine-dt - आर, 5&#39;-GCG CTA GAC आर जी गोरखा प्रशिक्षण केन्द्र टैग सी CGC-3 &#39;: ब्लंट समाप्त rhodamine लेबल टी -4 डीएनए ligase के साथ स्वस्थानी ligation के संकेत में वृद्धि के लिए बाल के लिये कांटा </li><li> चेचक डीएनए topoisomerase एल (Vacc Topo) - 3000 यू / μL (चमकीला टेक्नोलॉजीज). आरंभिक प्रयोगों में हम प्रतिक्रिया मिश्रण के हर 25 μL प्रति Vacc Topo के 215 pmoles (7.1 μg) का इस्तेमाल किया. हालांकि, topoisomerase एकाग्रता काफी संवेदनशीलता के नुकसान के बिना कम किया जा सकता है. हम बाद में इसी तरह के परिणाम के साथ प्रति Vacc Topo अनुभाग (अनुभाग प्रति प्रतिक्रिया मिश्रण की 25 μL में 1.76 μg) की एक चार गुना कम राशि का इस्तेमाल किया. 880 एनजी (प्रतिक्रिया मिश्रण के 25 μL में) एंजाइम की मात्रा को कम एक कमजोर संकेत और Vacc Topo के 8.8 एनजी के परिणामस्वरूप कोई detectable संकेत का उत्पादन किया. </li><li> टी -4 डीएनए ligase 5 यू / μL (Roche). यह अत्यधिक ध्यान केंद्रित ligase तैयारी हमारे प्रयोगात्मक शर्तों में सबसे अच्छा संकेत देता है. </li&gt; <li> टी -4 डीएनए ligase के लिए 10 x प्रतिक्रिया बफर: 660 Tris - एचसीएल मिमी, 50 मिमी, 10 मिमी dithioerythritol, 10 मिमी एटीपी, पीएच 7.5 (2 MgCl 20 डिग्री सेल्सियस) (Roche). प्रतिक्रिया बफर में एटीपी आसानी विगलन ठंड के दोहराव चक्र में नष्ट कर दिया है. अशेष भाजक छोटे 15-20 μL भागों और दुकान में बफर - 20 डिग्री सेल्सियस एक बार प्रयोग करें. </li><li> Bidistilled पानी में 30% (w / v) खूंटी - 8000 (सिग्मा) के समाधान. 15% प्रतिक्रिया मिश्रण में खूंटी-8000 दृढ़ता का पता लगाने को बढ़ावा देने, उसके घटकों की मात्रा अपवर्जन द्वारा प्रभावी सांद्रता बढ़ती है. </li><li> Proteinase कश्मीर (Roche) 20 मिलीग्राम / एमएल आसुत जल में स्टॉक समाधान. स्टोर में पीबीएस में प्रतिक्रिया का उपयोग 50mg/mL समाधान, स्टॉक से तैयार में 20 डिग्री सेल्सियस. पुन: उपयोग नहीं करो. </li><li> DAPI (वेक्टर प्रयोगशालाओं) के साथ Vectashield. </li><li> सोडियम बिकारबोनिट बफर: 50m एम 3 NaHCO 15m एम NaCl, 8.2 पीएच. </li><li> 22x22mm या 22x40mm कांच या प्लास्टिक coverslips. प्लास्टिक coverslips प्रतिक्रिया के दौरान बेहतर कर रहे हैं, वे एक के रूप मेंअनुभाग से निकालना आसान पुनः. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

हम विधानसभा और एक आणविक पैमाने पर एक topoisomerase प्रोटीन द्वारा संचालित डिवाइस के आवेदन को प्रदर्शित करता है. का निर्माण एक जैव आणविक सेंसर है जो उनके सिरों के लिए दो अलग अलग fluorophores संलग्न द्वारा ऊतक वर्गों में डीएनए टूट की दो प्रमुख प्रकार लेबल है.

अर्द्ध कृत्रिम आण्विक मशीन और इसके उपयोग के डीएनए नुकसान की जांच के लिए इन विट्रो विधानसभा में

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Bioengineering

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