Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta da concedere R01NS062842 dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke, National Institutes of Health (VVD) e dalle concessioni R21 NS064403 dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke, National Institutes of Health con ARRA (VVD) e R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria, National Institutes of Health (VVD).

Le sezioni per la macchina molecolare basata rilevamento deve essere preparato prima perché la loro preparazione richiede più tempo rispetto l&#39;assemblaggio del dispositivo molecolare. Il costrutto funziona bene con 5-6μm dello spessore di sezioni tagliate da paraformaldeide-fisso, inclusi in paraffina blocchi di tessuto. Utilizzare i marchi scivolo che mantengono sezioni e, come ProbeOn Inoltre diapositive carica e predepurata (Fisher Scientific) o simili. Si consiglia in un primo momento con un tessuto con un no...

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	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. 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In questo video mostriamo come assemblare e utilizzare un dual-etichettatura DNA sensore danni. Il sensore è una macchina molecolare guidata da bio-molecolari motore, un virus-encoded TOPO VACC proteina legata con componenti artificiali. Lo sviluppo ha presentato l&#39;esempio di un bio-enabled approccio che promuove l&#39;adattamento delle strutture biologiche, architetture e componenti effettivi e dei componenti delle cellule alla progettazione di atossici dispositivi su scala molecolare 12,15. Questo appr...

<ol><li> Xilene </li><li> 80 e 96% etanolo. </li><li> Soluzione al 2% di albumina di siero bovino (BSA) in acqua distillata. </li><li> Oligonucleotide 1: un&#39;arma a doppio tornante, doppio marcato con fluoresceina e tetrametilrodamina: </li></ol> 5&#39;-GGA AAG CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG R CAT IN GCG TT-3 &#39;; F - FITC-dT; R - tetrametilrodamina-dT. Altri rossi spostato fluorofori come BODIPY TR, rodamina o TAMRA può essere usato al posto di tetrametilrodamina come R. In alternativa puoi usare oligonucleotidi 2 -. Un&#39;arma a doppio tornante singolo marcato con fluoresceina (per il rilevamento di un singolo tipo di rotture del DNA (DNasi II-tipo solo) Il single-fluoroforo che trasporta la sonda è notevolmente meno costoso ed è comodo ogni volta che un singolo tipo di interruzione di DNA viene etichettato: 5&#39;-GGA AAG CCT GC F GCA TTA ACG GGT CCC ATG CGT CAT T-3 &#39;; F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleotide 3. Blunt-ended rodamina marcato tornante per la valorizzazione del segnale legatura in situ con DNA ligasi T4: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 &#39;; R - tetrametilrodamina-dT </li><li> Vaccinia DNA topoisomerasi l (VACC TOPO) - 3000 U / mL (Tecnologie Vivace). Negli esperimenti iniziali abbiamo usato 215 pmoli (7,1 mcg) del TOPO VACC per ogni microlitri 25 della miscela di reazione. Tuttavia, la concentrazione topoisomerasi può essere significativamente ridotto senza la perdita di sensibilità. Abbiamo poi usato una quantità quattro volte minore di VACC TOPO per sezione (1,76 mg in 25 ml di miscela di reazione per sezione) con risultati simili. Ridurre la quantità di enzima a 880 ng (in 25 microlitri della miscela di reazione) ha determinato un segnale più debole e 8,8 ng di VACC TOPO non ha prodotto alcun segnale rilevabile. </li><li> DNA ligasi T4 5 U / mL (Roche). Questa preparazione ligasi altamente concentrati dà il meglio di segnale nelle nostre condizioni sperimentali. </li&gt; <li> 10 x tampone di reazione per la DNA ligasi T4: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 dithioerythritol mm, 10 mm ATP, pH 7.5 (20 ° C) (Roche). ATP in tampone di reazione è facilmente distrutto in cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Aliquota del buffer in piccole porzioni 15-20 microlitri e conservare a - 20 ° C. Utilizzare una sola volta. </li><li> 30% (w / v) di PEG-8000 (Sigma) in acqua bidistillata. 15% PEG-8000 nella miscela di reazione stimola fortemente la rilevazione, aumentando la concentrazione efficace dei suoi componenti per esclusione del volume. </li><li> Proteinasi K (Roche) 20 mg / ml soluzione madre in acqua distillata. Conservare a - 20 ° C. Nella soluzione uso reazione 50mg/ml in PBS, prepara il. Non riutilizzare. </li><li> Vectashield con DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Tampone bicarbonato di sodio: 50m M NaHCO 3, 15m M di NaCl, pH 8.2. </li><li> Vetro 22x22mm o 22x40mm o lamelle di plastica. Coprioggetto plastica sono preferibili durante la reazione, in quanto unore più facile da rimuovere dalla sezione. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Naturale bio-molecolari macchine lavorano in ogni cellula vivente e visualizzare una varietà di disegni 1-6. Eppure lo sviluppo di macchine molecolari artificiali centri su dispositivi in grado di movimento direzionale, cioè motori molecolari, e sulla loro parti meccaniche in scala ridotta (ruote, assali, ecc pendenti) 7-9. Questo imita la macro-macchine, anche se le proprietà fisiche fondamentali per questi dispositivi, come ad esempio inerzia e conservazione del momento, non sono utilizzabili in ambienti nanomondo 10. Progetti alternativi, che non seguono gli schemi meccanici macromachines e utilizzare meccanismi sviluppati per l&#39;evoluzione delle molecole biologiche, possono usufruire delle condizioni specifiche del nanomondo. Inoltre, adattando reale molecole biologiche ai fini della nano-design riduce i pericoli potenziali dei prodotti delle nanotecnologie potrebbero comportare. Qui mostriamo il montaggio e l&#39;applicazione di uno di questi bio-enabled costruire, comeemi-artificiale dispositivo molecolare che combina una macchina in natura molecolare con componenti artificiali. Dal punto di vista enzimologia, il nostro costruire è una fluorescente progettista enzima-substrato complesso mettere insieme per svolgere una specifica funzione utile. Questa assemblea è per definizione una macchina molecolare, in quanto contiene un 12. Eppure, la sua integrazione con le progettato parte - fluorescenti a doppio tornante - ha re-indirizza a una nuova attività di etichettatura danno al DNA 12. Il nostro costruire assembla da un 32-mer DNA e un enzima vaccino topoisomerasi I (VACC TOPO). La macchina utilizza poi il proprio materiale per fabbricare due unità rivelatore fluorescente (Figura 1). Una delle unità (fluorescenza verde) porta VACC TOPO covalentemente legata al suo 3&#39;end e un&#39;altra unità (fluorescenza rossa) è un tornante libero con un 3&#39;OH terminale. Le unità sono di breve durata e rimontare rapidamente nuovamente dentro il costrutto originale, che recleaves successivamente.In assenza di rotture del DNA queste due unità separate e in continuo religate in modo ciclico. In sezioni di tessuto con danno al DNA, la topoisomerasi che trasportano unità di rilevatore si attacca selettivamente a blunt-ended con 5&#39;OH rotture del DNA (DNasi II di tipo break) 11,12, fluorescente loro etichettatura. Il secondo, enzima senza tornante formata a seguito della scissione oligonucleotidi, sarà legare ad un 5&#39;PO 4 smussato-ended break (DNasi I di tipo break) 11,12, se il DNA ligasi T4 è presente nella soluzione 13,14. Quando il DNA ligasi T4 viene aggiunto a una sezione di tessuto o di una soluzione contenente DNA con 5&#39;PO 4 blunt-ended pause, la ligasi reagisce con 5&#39;PO 4 estremità del DNA, formando semi-stabile enzima-DNA complessi. I tornanti smussato conclusa potranno interagire con questi complessi rilasciando tornanti ligasi e il collegamento covalente al DNA, così etichettatura 5&#39;PO 4 blunt-ended rotture del DNA. Questo sviluppo esemplifica un nuovo approccio pratico °progettazione e di macchine molecolari e fornisce un utile sensore per il rilevamento di apoptosi e danno al DNA nelle cellule e nei tessuti fissi.

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Dimostriamo il montaggio e l&#39;applicazione di una scala molecolare dispositivo alimentato da una proteina topoisomerasi. Il costrutto è un bio-sensore molecolare che le etichette due tipi principali di rotture del DNA nelle sezioni di tessuto allegando due fluorofori diversi per i loro fini.

In Assemblea in vitro di semi-artificiale della macchina molecolare e il suo utilizzo per il rilevamento del danno al DNA

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

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receive the results. ...

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