Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

この研究は、国立神経疾患研究所と脳卒中、国立衛生研究所（VVD）からと神経疾患や脳卒中、国立ARRAを通じて衛生研究所（VVD）とR21の国立研究所からR21 NS064403の補助金によって助成金R01NS062842によってサポートされていました生体イメージングとバイオのEB006301国立研究所、健康（VVD）の国立研究所。

それらの調製方法は、分子デバイスの組立よりも時間がかかるため、分子機械ベースの検出のためのセクションは、最初に準備する必要があります。構造はパラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋組織ブロックから切り出した5量6μm厚のセクションでうまく動作します。このようなProbeOnプラスに帯電しprecleanedスライド（フィッシャーサイエンティフィック）または同様の同様のセクショ...

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	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines.">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li><li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+machines,+Maxwell's+demon+and+living+organisms.">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li><li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+as+a+molecular+machine.">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li><li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

このビデオでは、我々は、デュアルラベリングDNA損傷のセンサーを組み立て、使用する方法を示します。センサーは、生体分子のエンジン、人工的なコンポーネントにリンクされているウイルスでエンコードされたタンパク質VACCのTOPOによって駆動分子機械です。提示の開発は、非毒性の分子スケールデバイス12,15の設計に生物学的構造、アーキテクチャとセルの実際の部品とコンポ?...

<ol><li>キシレン</li><li> 80および96％エタノール。 </li><li>蒸留水でウシ血清アルブミン（BSA）の2％溶液。 </li><li>オリゴヌクレオチド1：ダブルヘアピン、デュアルフルオレセイン、テトラメチルローダミンで標識した。 </li></ol> 5&#39; - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT GCG TT - 3&#39;AT R、F - FITC - DT; R -テトラメチルローダミン- dTが。このようなBODIPY TR、ローダミンまたはTAMRAなど、他の赤色シフト蛍光体はRとしてテトラメチルローダミンの代わりに使用することができます。 あるいは、オリゴヌクレオチド2を使用することができます - フルオレセインで標識された二重ヘアピンのシングルを（DNA切断のシングルタイプ（DNase処理II型のみ）を検出するための単一フルオロフォアを運ぶプローブはかなり安価で、いつでもシングル便利です。 DNA区切りの種類が分類されることになります：5&#39; - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T - 3&#39;; F - FITC - dTを</p&gt; <ol start="5"><li>オリゴヌクレオチド3。 T4 DNAリガーゼを用いたin situライゲーションの信号での強化のための平滑末端ローダミン標識ヘアピン：5&#39; - GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC - 3&#39;; R -テトラメチルローダミン- dTを</li><li>ワクシニアDNAトポイソメラーゼL（VACC TOPO） - 3000 U /μL（ビビッドテクノロジーズ）。初期の実験では、反応混合物の各25μLあたりVACC TOPO 215ピコモル（7.1μg）を使用。しかし、トポイソメラーゼの濃度が大幅に感度を失うことなく減少させることができます。我々は、後で同じような結果とセクションごとにVACC TOPO（セクションごとに反応ミックス25μLの1.76μg）の4倍より少ない量を使用していました。 880 ngの（反応ミックス25μLで）への酵素の量を減らす弱い信号をもたらしたとVACC TOPOの8.8 ngのは、検出可能なシグナルを産生しなかった。 </li><li> T4 DNAリガーゼ5 U /μL（ロシュ）。この高濃度のリガーゼの準備は、我々の実験条件における最適な信号を提供します。 </l私&gt; <li> T4 DNAリガーゼ用10 ×反応バッファー：660 mMのトリス- HCl、50 mMのMgCl 2、10mMのジチオエリトリトール、10mMのATP、pHが7.5（20℃）（ロシュ）。反応緩衝液中のATPは、容易に凍結を融解の反復的なサイクルで破棄されます。アリコートで小さい15から20μLの部分とストア内のバッファ - 20℃で一度だけ使用してください。 </li><li> 30％（w / v）の蒸留水でのPEG - 8000の溶液（シグマ）。 15％は反応ミックス中のPEG - 8000を強くボリュームの排除によって、その成分の有効濃度を増加させる、検出を刺激する。 </li><li>プロテイナーゼK（Roche社）を蒸留水に20 mg / mlのストック溶液。で保管して - 20℃の反応では株式から調製した、PBSで50mg/mLのソリューションを使用してください。再使用しないでください。 </li><li> DAPIとVectashield（ベクターラボラトリーズ）。 </li><li>炭酸水素ナトリウム緩衝液：50メートルM NaHCO 3を 、15メートルのNaCl、pHは8.2。 </li><li> 22x22mmまたは22x40mmガラスまたはプラスチック製のカバースリップ。プラスチック製カバースリップは、彼らのように、反応中に好ましいセクションから削除するには、簡単に再。 </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

天然由来のバイオ分子のマシンはすべての生きている細胞では機能とデザインを1-6の様々な表示。まだ方向運動、すなわち分子モーターの対応デバイス上で、そしてそのスケールダウンした機械部品（ホイール、アクスル、ペンダント等）7-9人工分子機械の中心の開発。これは、慣性と運動量の保存など、これらのデバイスに不可欠な物理特性は、ナノワールドの環境で10に使用できないにもかかわらず、マクロマシンを模したもの。機械的なmacromachinesスキームに従い、生体分子の進化に開発した機構を使用しない代替デザインは、、ナノワールドの特定の条件を活用することができます。に加えて、ナノ設計の目的のために実際の生体分子を適応させるナノテクノロジー製品がもたらす可能性のある潜在的な危険を減らすことができます。ここでは、そのようなバイオ対応構造のアセンブリとアプリケーションを示すように人工的な成分で、天然に存在する分子機械を組み合わせたEMI -人工分子デバイス。ビューの酵素学の観点から、私たちの構造は、デザイナーの蛍光酵素基質複合体の特定の有用な機能を実行するために一緒に入れています。それは1つの12が含まれているとして、このアセンブリは、定義により分子機械です。まだ、エンジニアリング部との統合-蛍光二重ヘアピン- DNA損傷12を標識する新しいタスクにそれを再指示する。 私たちの構造は32量体DNAと酵素ワクトポイソメラーゼI（VACC TOPO）から組み立てます。マシンは、2つの蛍光標識検出器ユニット（図1）を製造するために、独自の材料を使用しています。ユニットの一つ（緑色蛍光）が運ぶ共有結合その3&#39;末端と別のユニット（赤色蛍光）に接続されているVACC TOPOは、ターミナル3&#39;OH無料ヘアピンです。ユニットは短命で、すぐにその後recleavesオリジナルの構造に戻し、組み立て直す。DNAの非存在下で周期的に継続的に独立したとreligateこれら二つのユニットを壊します。 DNA損傷による組織切片では、トポイソメラーゼを運ぶ検出器ユニットは、選択的に蛍光ラベルを付けます、5&#39;OHと平滑末端DNAの切断（DNase処理II型改）11,12に接続します。オリゴヌクレオチド開裂の後に形成された第二、酵素のないヘアピンT4 DNAリガーゼは、ソリューション13,14内に存在する場合、5&#39;PO 4平滑末端ブレーク（DNアーゼI -型改）11,12、にライゲートされます。 T4 DNAリガーゼは、組織切片または5&#39;PO 4平滑末端切断したDNAを含む溶液に添加されると、リガーゼは、準安定酵素- DNA複合体を形成し、5&#39;PO 4 DNAの末端と反応する。平滑末端ヘアピンは、このように5&#39;PO 4平滑末端DNAの切断をラベリング、DNAにリガーゼと共有結合リンクのヘアピンをリリースするこれらの複合体と相互に作用します。 この開発は、番目に新しい実用的なアプローチを例示している電子の分子機械の設計とは、固定された細胞や組織におけるアポトーシスとDNA損傷の検出に有用なセンサーを提供します。

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

我々は、トポイソメラーゼのタンパク質を搭載した分子スケールデバイスのアセンブリとアプリケーションを示しています。構造は、その両端に二つの異なる蛍光色素を付加することにより組織切片におけるDNA切断の2つの主要なタイプを標識する生体分子センサーです。

DNA損傷の検出のための半人工分子機械とその使用のin vitroでの組立に

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

ハイスループットの使用<em&gt;インビトロ</emオーラル多種バイオフィルムを開発するために&gt;マイクロ流体システム

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

建設と質間葉系幹細胞の骨分化を強化するため電気刺激室の使用

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...