Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
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이 연구는 국립 신경 장애 연구소 및 행정, 건강의 국립 연구소 (VVD)로부터 신경 장애 및 뇌졸중, 국민 ARRA를 통해 보건 연구소 (VVD)과 R21의 국립 연구소에서 R21 NS064403 부여하여 부여 R01NS062842에 의해 지원되었다 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 EB006301 국립 연구소, 건강 (VVD)의 국립 연구소.

자신의 준비는 분자 장치의 조립보다 더 많은 시간을 소요하기 때문에 분자 기계 기반의 탐지에 대한 부분 먼저 준비되어야합니다. 구조는 paraformaldehyde - 고정, 파라핀 - 임베디드 조직 블록에서 컷 5 6μm 두께 부분과 잘 작동합니다. 이러한 ProbeOn 플러스 충전 및 precleaned 슬라이드 (피셔 과학) 또는 유사한뿐만 아니라 섹션을 유지 슬라이드 브랜드를 사용합니다. 우리는 최초의 dexamethasone - apoptotic ?...

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이 비디오에서는, 우리는 이중 라벨의 DNA 손상 센서를 조립하고 사용하는 방법을 보여줍니다. 센서는 생체 분자 엔진, 인공 구성 요소와 연결된 바이러스 인코딩된 단백질 VACC의 TOPO에 의한 분자 기계입니다. 표시 개발 무독성 분자 규모의 장치 12,15의 디자인에 생물 학적 구조, 아키텍쳐 및 세포의 실제 부품과 구성 요소를 채택 옹호 생체 활성화된 접근 방식을 exemplifies. 1 :이 방법은 ?...

<ol><li> 크실렌 </li><li> 80 96 % 에탄올. </li><li> 증류수에 (BSA) 소 혈청 알부민의 2 % 솔루션입니다. </li><li> Oligonucleotide 1 : 이중 머리핀, 이중이 플루오레신 및 tetramethylrhodamine으로 표시 : </li></ol> GCG AT 5&#39; - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT는 R TT - 3 &#39;; F - FITC - DT, R - Tetramethylrhodamine - DT. 이러한 BODIPY TR, rhodamine 또는 TAMRA 같은 다른 빨간 이동 fluorophores은 R 대신 tetramethylrhodamine에 사용할 수 있습니다. 또는 당신은 Oligonucleotide 2 사용할 수 있습니다 -. 플루오레신으로 표시 더블 머리 핀의 자형으로 단일 (DNA 나누기의 하나의 유형 (DNase II 타입 전용)의 검출을위한 단일 형광단 운반 탐사선이 상당히 저렴하고 편리한 때마다 단일 DNA 나누기의 유형은 표시되어야하는 것입니다 : 5&#39; - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T - 3 &#39;; F - FITC - DT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleotide 3. Tetramethylrhodamine - DT - R, 5&#39; - GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC - 3 &#39;T4 DNA ligase와 함께 현장의 결합 신호에의 향상을 위해 무딘 엔드 rhodamine - 라벨이 머리핀 </li><li> 우두 DNA topoisomerase L (VACC TOPO) - 3,000 U / μL (생생한 기술). 초기 실험에서 우리는 반응 믹스의 모든 25 μL 당 VACC TOPO의 215 pmoles (7.1 μg)를 사용합니다. 그러나, topoisomerase 농도는 상당히 감성의 손실없이 줄일 수 있습니다. 우리는 나중에 유사한 결과를 섹션당 VACC TOPO (섹션당 반응 믹스 25 μL의 1.76 μg)의 4 배 낮은 금액을 사용합니다. 880 NG (반응 믹스 25 μL)로 효소의 양을 줄이는 것은 약한 신호와 VACC TOPO의 8.8 NG 결과는 감지 신호를 생산하지 않습니다. </li><li> T4 DNA ligase 5 U / μL (Roche는). 이 고도로 집중 ligase 준비 우리가 실험 조건에서 최고의 신호를 제공합니다. </lI&gt; <li> T4 DNA ligase 10 X 반응 버퍼 : 660 MM 트리스 - HCL, 50 MM MgCl 2, 10 MM의 dithioerythritol, 10 MM ATP, 산도 7.5 (20 ° C) (Roche는). 반응 버퍼 ATP는 쉽게 해동 - 냉동의 반복 사이클에서 파괴됩니다. 나누어지는는 다음 위치에서 작은 15-20 μL 부분과 저장소에있는 버퍼 - 20 ° C. 한번 사용합니다. </li><li> bidistilled 물에 PEG - 8000 (시그마)의 30 % (W / V)이 솔루션입니다. 15% 반응 믹스에서 PEG - 8000 강력하게 볼륨 제외하여 성분의 효과적인 농도를 증가, 검색을 자극. </li><li> 증류수의 Proteinase K (Roche는) 20 밀리그램 / ML 재고 솔루션입니다. 에 저장 - 주식에서 준비 PBS의 반응을 사용 50mg/mL 솔루션, 20 ° C.. 재사용하지 마십시오. </li><li> DAPI (벡터 연구소)와 Vectashield. </li><li> 나트륨 중탄산염 버퍼 : 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH를 8.2. </li><li> 22x22mm 또는 22x40mm 유리 또는 플라스틱 coverslips. 플라스틱 coverslips들은 같은 반응 동안 좋습니다 아르섹션에서 제거할 쉽게 다시. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

자연스럽게 발생하는 생체 분자 기계는 모든 살아있는 세포에서 작업과 디자인 1-6 다양한 표시됩니다. 그러나 방향 운동, 즉 분자 모터 수있는 장치에 대한, 그들의 스케일 다운 기계 부품 (바퀴, axels, 펜던트 등) 7-9에서 인공 분자 기계 센터의 개발. 이것은 관성과 운동량 보존 이러한 장치에 대한 필수적인 물리적 속성, nanoworld 환경 10 사용할 수없는 경우에도 매크로 시스템을 imitates. 기계 macromachines 계획에 따라 생물 학적 분자의 진화에 개발한 메커니즘을 사용하지 않는 대체 디자인, nanoworld의 특정 조건을 활용할 수 있습니다. 게다가, 나노 디자인의 목적을 위해 실제 생물 학적 분자를 채택하면 나노 제품 포즈 수있는 잠재적인 위험을 줄여줍니다. 여기는, 하나의 바이오 기반 구조의 조립 및 애플 리케이션을 설명인공 구성 요소와 자연 - 발생 분자 기계를 결합하여 EMI - 인공 분자 장치. 보기의 enzymology 지점에서, 우리의 구조는 디자이너 형광 효소 - 기질 복합 특정 유용한 기능을 수행하기 위해 함께 들어가게된다. 그 하나의 12가 들어 있으므로이 어셈블리는 정의에 의해 분자 기계입니다. 그러나, 설계 부분와의 통합 - 형광 듀얼 머리 핀의 자형 - DNA 손상 12 라벨링의 새로운 작업에 다시 번 지휘하고 있습니다. 우리의 구조는 32 메르 DNA와 효소 우두 topoisomerase I (VACC TOPO)의 밖으로 조립. 기계 후 두 찬란 표시 검출기 단위 (그림 1)를 조작하기 위해 자신의 소재를 사용합니다. 단위 중 하나는 (녹색 형광) covalently의 3&#39;end와 다른 장치 (적색 형광)에 연결된 VACC TOPO가 터미널 3&#39;OH와 함께 무료로 머리핀입니다시킵니다. 단위도 잊혀하고 신속 이후 recleaves 원래 구조로 다시 재조 립.DNA의 부재에서는 순환 방식으로 연속적으로 분리하여 religate이 두 단위 나옵니다. DNA 손상, topoisomerase 운반 검출기 단위 선택 찬란를 라벨, 5&#39;OH (DNase II 타입 나누기) 11,12과 무딘 엔드의 DNA 휴식에 부착과 조직 섹션에. T4 DNA ligase에이 솔루션 13,14에있는 경우 oligonucleotide 절단 후 형성 둘째, 효소 - 무료 머리핀은 5&#39;PO 4 무딘 엔드 휴식 (DNase I - 타입 휴식) 11,12에 ligate 것입니다. T4 DNA ligase의가 조직의 섹션 또는 5&#39;PO 4 무딘 엔드 휴식과 DNA를 포함하는 솔루션에 추가되면, ligase 준 안정 효소 - DNA의 단지를 형성, 5&#39;PO 네 DNA 종료와 함께 반응. 무딘 종료된 헤어핀 따라서 5&#39;PO 4 무딘 엔드의 DNA 나누기를 라벨, DNA에 ligase와 covalently 연결 헤어핀를 방출이 단지와 상호 작용합니다. 이 개발 일에 새로운 실용적인 접근 방식을 exemplifies전자 분자 기계의 설계 및 고정 세포 및 조직에서 apoptosis와 DNA 손상의 검출에 유용한 센서를 제공합니다.

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

우리는 topoisomerase 단백질에 의해 구동되는 분자 규모의 장치의 조립 및 응용 프로그램을 보여줍니다. 구조는 끝이 두 가지 다른 fluorophores을 첨부하여 조직 섹션에서 DNA 나누기의 두 가지 주요 유형의 레이블 생체 분자 센서이다.

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