Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet med tilskudd R01NS062842 fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag, National Institutes of Health (VVD) og ved bevilgninger R21 NS064403 fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag, National Institutes of Health gjennom Arra (VVD) og R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi, National Institutes of Health (VVD).

Delene for molekylær maskin-basert gjenkjenning bør være forberedt første fordi deres forberedelser tar mer tid enn montering av molekylære enheten. Den konstruerer fungerer godt med 5-6μm tykke seksjoner kuttet fra Paraformaldehyde-fast, parafin-embedded tissue blokker. Bruk skyv merker som beholder deler godt, slik som ProbeOn Plus ladet og precleaned lysbilder (Fisher Scientific) eller lignende. Vi anbefaler å først bruke en vev med et velkjent mønster av DNA-skade som inneholder både DNase I-og DNase II-ty...

<ol>
	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines.">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li><li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+machines,+Maxwell's+demon+and+living+organisms.">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li><li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+as+a+molecular+machine.">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li><li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

I denne videoen viser vi hvordan å sette sammen og bruke en dual-merking DNA skade sensor. Sensoren er en molekylær maskin drevet av bio-molekylær-motoren, en virus-kodet protein Vacc Topo forbundet med kunstige komponenter. Den presenterte utviklingen eksemplifiserer en bio-aktivert tilnærming som talsmenn tilpasse biologiske strukturer, arkitekturer og faktiske deler og komponenter av celler til utforming av ikke-giftig molekylær skala enheter 12,15. Denne tilnærmingen løser to problemer som ligger t...

<ol><li> Xylen </li><li> 80 og 96% etanol. </li><li> 2% løsning av bovint serum albumin (BSA) i destillert vann. </li><li> Oligonukleotid 1: en dobbel-hårnål, dual merket med fluorescein og tetramethylrhodamine: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R PÅ GCG TT-3 &#39;; F - FITC-dT; R - Tetramethylrhodamine-dT. Andre røde flyttet fluorophores som BODIPY TR, rhodamine eller Tamra kan brukes i stedet for tetramethylrhodamine som R. Alternativt kan du bruke oligonukleotid 2 -. Dobbel-hårnål singel merket med fluorescein (for deteksjon av en enkelt type DNA pauser (DNase II-type) Den single-fluoroforen-bærer probe er betydelig mindre kostbart og er praktisk når en enkelt type DNA bruddet er å være merket: 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonukleotid 3. Blunt-ended rhodamine-merket hårnål for forbedring av in situ ligation signal med T4 DNA ligase: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC Tags CGC-3 &#39;; R - Tetramethylrhodamine-dT </li><li> Vaccinia DNA-topoisomerase l (Vacc topo) - 3000 U / mL (Vivid Technologies). I de innledende forsøkene brukte vi 215 pmoles (7,1 mikrogram) av Vacc Topo per hver 25 mL av reaksjonen mix. Imidlertid kan topoisomerase konsentrasjonen reduseres betydelig uten tap av følsomhet. Vi har senere brukt en fire ganger mindre mengde Vacc Topo per seksjon (1,76 mg i 25 mL av reaksjonen mix per seksjon) med lignende resultater. Redusere mengden av enzymet til 880 ng (i 25 mL av reaksjonen mix) resulterte i en svakere signal og 8,8 ng av Vacc Topo produseres ingen påvisbare signal. </li><li> T4 DNA ligase 5 U / mL (Roche). Denne svært konsentrert ligase forberedelse gir best signal i våre eksperimentelle forhold. </li&gt; <li> 10 x reaksjon buffer for T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mm 2 MgCl, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, 7,5 pH (20 ° C) (Roche). ATP i reaksjonen buffer er lett ødelagt i repeterende sykluser etter tining-frysing. Delmengde buffer i små 15-20 mL porsjoner og oppbevar ved - 20 ° C. Bruk en gang. </li><li> 30% (w / v) løsning av PEG-8000 (Sigma) i bidistilled vann. 15% PEG-8000 i reaksjonen mix stimulerer sterkt deteksjon, øker den effektive konsentrasjoner av dens bestanddeler i volum eksklusjon. </li><li> Proteinase K (Roche) 20 mg / ml stamløsning i destillert vann. Oppbevares ved - 20 ° C. I reaksjonen bruk 50mg/mL løsning i PBS, tilberedt fra lager. Ikke gjenbruk. </li><li> Vectashield med DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Natriumbikarbonat buffer: 50m M 3 NaHCO, 15m M NaCl, 8,2 pH. </li><li> 22x22mm eller 22x40mm glass eller plast Dekkglass. Plastic Dekkglass er å foretrekke under reaksjonen, som de enre lettere å fjerne fra seksjonen. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Naturlig forekommende bio-molekylære maskiner arbeid i hver levende celle og vise en rekke design 1-6. Men utviklingen av kunstige molekylære maskiner sentre på enheter i stand til retningsbestemt bevegelse, dvs. molekylære motorer, og på deres nedskalert mekaniske deler (hjul, aksler, smykker etc) 7-9. Dette imiterer makro-maskiner, selv om de fysiske egenskapene avgjørende for disse enhetene, som treghet og momentum bevaring, er ikke brukbare i nanoworld miljøer 10. Alternative designs, som ikke følger mekaniske macromachines ordninger og bruk mekanismer utviklet i evolusjonen av biologiske molekyler, kan dra nytte av de konkrete forholdene i nanoworld. Dessuten tilpasser faktiske biologiske molekyler i forbindelse med nano-design reduserer potensielle farer nanoteknologi produktene kan utgjøre. Her kan vi demonstrere montering og anvendelse av en slik bio-aktivert konstruere, somEMI-kunstig molekylær enhet som kombinerer en naturlig forekommende molekylær maskin med kunstig komponenter. Fra enzymologi synspunkt, er vår konstruere en designer fluorescerende enzym-substrat kompleks satt sammen for å utføre en bestemt nyttig funksjon. Denne forsamlingen er per definisjon en molekylær maskin, da det inneholder en 12. Likevel, dets integrasjon med konstruerte delen - dirigerer re-den til en ny oppgave merking DNA-skader 12 - fluorescerende dual hårnål. Våre konstruere samler ut av en 32-mer DNA og enzymet vaccinia topoisomerase I (Vacc topo). Maskinen bruker deretter sitt eget materiale for å dikte to fluorescensmerkede detektor enheter (figur 1). En av enhetene (grønn fluorescens) bærer Vacc Topo kovalent festet til sin 3&#39;end og en annen enhet (rød fluorescens) er et gratis hårnål med en terminal 3&#39;OH. Enhetene er kortvarige og raskt montere tilbake til den opprinnelige konstruere, som senere recleaves.I fravær av DNA bryter disse to enhetene fortløpende separate og religate i en syklisk måte. I vev seksjoner med DNA-skade, topoisomerase-bærer detektor enhet selektivt festes til stump-ended DNA bryter med 5&#39;OH (DNase II-type pauser) 11,12, fluorescensmerket merking dem. Den andre, enzym-free hårnål dannet etter oligonukleotid cleavage, vil ligate til en 5&#39;PO 4 stump-ended pause (DNase I-typen pauser) 11,12, hvis T4 DNA ligase er til stede i løsningen 13,14. Når T4 DNA ligase er lagt til en vev avsnitt eller en løsning som inneholder DNA med 5&#39;PO 4 sløv-ended pauser, reagerer ligase med 5&#39;PO fire DNA ender, forming semi-stabile enzym-DNA komplekser. Den butte endte hårnåler vil samhandle med disse kompleksene frigjøre ligase og kovalent linking hårnåler til DNA, og dermed merking 5&#39;PO 4 stump-endte DNA pauser. Denne utviklingen eksemplifiserer en ny praktisk tilnærming til the utforming av molekylære maskiner og gir en nyttig sensor for deteksjon av apoptose, og DNA-skader i faste celler og vev.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Vi viser montering og anvendelse av en molekylær skala enhet drevet av en topoisomerase protein. Den konstruere er en bio-molekylær sensor hvilke etiketter to hovedtyper av DNA brudd i vev seksjoner ved å feste to forskjellige fluorophores til sine formål.

In vitro Montering av Semi-kunstig Molecular Machine og dens bruk for påvisning av DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

CometChip: En High-throughput for måling DNA Damage i Microarrayed menneskeceller 96-Well Platform

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Bruk av en High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrofluid System for å utvikle muntlige Multi-arter Biofilm

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning og montering av 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatisert robot flytende håndtering samlingen av modulære DNA enheter

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Syntese av kationiserte Magnetoferritin for Ultra-rask Magnetization Celler

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Bygging og bruk av en elektrisk stimulering kammer for å styrke Osteogenic differensiering i Mesenchymal Stem/Stromal celler i Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikkel Mikroarrayer for kjemotaktisk og molekylær analyse av human nøytrofil svermer in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...