Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

Esta pesquisa foi suportada por subvenção R01NS062842 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame, National Institutes of Health (VVD) e por doações R21 NS064403 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame, National Institutes of Health através ARRA (VVD) e R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging e Bioengenharia, National Institutes of Health (VVD).

As seções para a detecção baseada em máquina molecular deve ser preparado em primeiro lugar porque a sua preparação leva mais tempo do que a montagem do dispositivo molecular. A construção funciona bem com 5-6μm de espessura, corte de paraformaldeído fixo, blocos de parafina do tecido. Use marcas de slides que retêm seções bem, como ProbeOn Além disso slides carregada e precleaned (Fisher Scientific) ou similar. Recomendamos em primeiro lugar usando um tecido com um padrão conhecido de dano ao DNA, que c...

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	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. 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M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

Neste vídeo, demonstramos como montar e usar um dual-rotulagem sensor de danos ao DNA. O sensor é uma máquina molecular impulsionada por bio-molecular do motor, um vírus proteína codificada TOPO VACC ligados com componentes artificiais. O desenvolvimento apresentado exemplifica uma abordagem bio-enabled que defende a adaptação das estruturas biológicas, arquiteturas e peças e componentes reais de células para o projeto de não-tóxico dispositivos à escala molecular 12,15. Esta abordagem resolve du...

<ol><li> Xileno </li><li> 80 e Etanol a 96%. </li><li> Solução 2% de albumina bovina (BSA) em água destilada. </li><li> Oligonucleotídeo 1: um grampo duplo, dual marcado com fluoresceína e tetrametilrodamina: </li></ol> 5&#39;-GGA AAG CCT GC F GGT GCA CCC ATT ACG CAT R AT GCG TT-3 &#39;; F - FITC-dT; R - tetrametilrodamina-dT. Outros vermelho deslocado fluoróforos, tais como BODIPY TR, rodamina ou TAMRA pode ser usado em vez de R tetrametilrodamina como. Alternativamente, você pode usar 2 Oligonucleotide -. Hairpin uma única dupla marcada com fluoresceína (para a detecção de um único tipo de quebras de DNA (DNase II tipo apenas) A sonda single-fluoróforo de transporte é consideravelmente menos caro e é conveniente sempre que um único tipo de quebra de DNA deve ser rotulado: 5&#39;-GGA AAG CCT GC F GGT GCA CCC ATT ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleotídeo 3. Blunt-ended rodamina marcado hairpin para o realce do sinal de ligadura situ com DNA ligase T4: 5&#39;-GCG CTA GAC C G R GTC TAG CGC-3 &#39;; R - tetrametilrodamina-dT </li><li> Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC TOPO) - 3000 U / mL (Vivid Technologies). Nos experimentos iniciais foram utilizados 215 pmoles (7,1 mg) do TOPO VACC por cada mL 25 da mistura de reacção. No entanto, a concentração topoisomerase pode ser significativamente reduzido sem perda de sensibilidade. Mais tarde, usou uma quantidade quatro vezes menor de VACC TOPO por seção (1,76 g em 25 mL da mistura de reação por seção) com resultados semelhantes. Reduzir a quantidade da enzima a 880 ng (em 25 mL da mistura de reação) resultou em um sinal mais fraco e 8,8 ng de VACC TOPO não produziu nenhum sinal detectável. </li><li> DNA ligase T4 5 U / mL (Roche). Esta preparação altamente concentrada ligase dá o melhor sinal em nossas condições experimentais. </li&gt; <li> 10 x tampão de reação para a T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 Ditioeritritol mM, 10 mM ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP em tampão de reação é facilmente destruído em ciclos repetitivos de descongelamento-congelamento. Alíquota do buffer em pequenas porções 15-20 mL e armazenar a - 20 ° C. Use uma vez. </li><li> 30% (w / v) solução de PEG-8000 (Sigma) em água bidestilada. 15% PEG-8000 na mistura de reacção fortemente estimula a detecção, aumentando as concentrações eficazes dos seus constituintes, por exclusão de volume. </li><li> Proteinase K (Roche) 20 solução estoque mg / mL em água destilada. Armazenar a - 20 ° C. Na solução use reação 50mg/ml em PBS, preparado a partir do estoque. Não reutilize. </li><li> Vectashield com DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Tampão de bicarbonato de sódio: 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8,2. </li><li> Vidro 22x22mm ou 22x40mm ou lamelas de plástico. Lamínulas de plástico são preferíveis durante a reação, já que umre mais fácil de remover da seção. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Naturalmente bio-molecular máquinas de trabalho em cada célula viva e exibir uma variedade de modelos 06/01. No entanto, o desenvolvimento de centros artificial molecular máquinas em dispositivos capazes de movimento direcional, ou seja, motores moleculares, e sobre a sua escala reduzida partes mecânicas (rodas, eixos, etc pingentes) 7-9. Este imita as máquinas macro-, mesmo que as propriedades físicas essenciais para estes dispositivos, tais como a inércia ea conservação do momento, não são utilizáveis ​​em ambientes nanoworld 10. Projetos alternativos, que não seguem os esquemas mecânicos macromachines e usar mecanismos desenvolvidos na evolução de moléculas biológicas, pode aproveitar as condições específicas do mundo nano. Além disso, adaptando reais de moléculas biológicas para fins de nano-design reduz perigos em potencial dos produtos da nanotecnologia pode representar. Aqui demonstramos a montagem e aplicação de uma construção bio-enabled tais, comoemi-artificial dispositivo molecular que combina uma máquina molecular de ocorrência natural com componentes artificiais. Do ponto de vista enzimologia, a nossa construção é um designer complexo enzima-substrato fluorescente colocados juntos para executar uma função específica útil. Este conjunto é, por definição, uma máquina molecular, uma vez que contém um 12. No entanto, sua integração com a parte de engenharia - hairpin dupla fluorescentes - re-direciona para uma nova tarefa de rotulagem danos no DNA 12. Nossa construção reúne a partir de um DNA 32-mer e uma enzima topoisomerase I vaccinia (VACC TOPO). A máquina então usa seu próprio material para fabricar duas unidades detector fluorescente etiquetado (Figura 1). Uma das unidades (fluorescência verde) carrega VACC TOPO covalentemente ligado a seu 3&#39;end e outra unidade (fluorescência vermelha) é um hairpin livre com uma 3&#39;OH terminal. As unidades são de curta duração e rapidamente montar de volta para a construção original, que posteriormente recleaves.Na ausência de DNA quebra estas duas unidades separadas de forma contínua e religate de uma forma cíclica. Em cortes de tecidos com danos no DNA, a unidade de transporte de detector topoisomerase seletivamente atribui a quebra ponta e DNA com 5&#39;OH (DNase II tipo-breaks) 11,12, fluorescente rotulá-los. O segundo, hairpin enzima livre formado após clivagem oligonucleotídeo, vai a uma ligadura 5&#39;PO 4 quebrar blunt-ended (DNase I tipo-breaks) 11,12, se ligase T4 DNA está presente na solução 13,14. Quando ligase T4 DNA é adicionado a uma secção de tecido ou uma solução contendo DNA com 4 5&#39;PO ponta e breaks, a ligase reage com 5&#39;PO quatro extremidades do DNA, formando semi-estável da enzima DNA-complexos. Os grampos de cabelo sem corte terminou irá interagir com estes complexos liberando hairpins ligase e covalentemente ligados a DNA, assim rotulagem 5&#39;PO quatro breaks ponta e DNA. Este desenvolvimento exemplifica uma nova abordagem prática para podesign e de máquinas moleculares e fornece um sensor de útil para a detecção de apoptose e dano de DNA em células fixas e tecidos.

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Nós demonstramos a montagem e aplicação de um dispositivo em escala molecular alimentado por uma proteína topoisomerase. A construção é um sensor de bio-molecular que rotula dois principais tipos de quebras de DNA em cortes de tecido, anexando dois fluoróforos diferentes para os seus fins.

Em Assembléia in vitro de Semi-artificial máquina molecular e sua utilização para detecção de danos no DNA

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

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receive the results. ...

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