Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

Denna forskning stöds av bidrag R01NS062842 från National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke, National Institutes of Health (VVD) och genom bidrag R21 NS064403 från National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke, National Institutes of Health genom Arra (VVD) och R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging och bioteknik, National Institutes of Health (VVD).

Sektionerna för molekylär maskin-baserad detektering bör förberedas först, eftersom deras förberedelser tar längre tid än monteringen av molekylära enhet. Den konstruera fungerar bra med 5-6μm tjocka sektioner klippt från paraformaldehyd-fast, paraffininbäddade vävnadssnitt block. Använd bilden varumärken som behåller delar också, såsom ProbeOn Plus laddad och precleaned diabilder (Fisher Scientific) eller liknande. Vi rekommenderar till en början med hjälp av en vävnad med ett välkänt mönster av...

<ol>
	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines.">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li><li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+machines,+Maxwell's+demon+and+living+organisms.">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li><li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+as+a+molecular+machine.">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li><li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

I den här videon visar vi hur du monterar och använder en dual-märkning sensor DNA-skador. Sensorn är en molekylär maskin som drivs av biomolekylära motor, ett virus-protein som bildas VACC TOPO samband med artificiella komponenter. De presenterade utvecklingen exemplifierar en bio-aktiverad synsätt som förespråkar att anpassa biologiska strukturer, arkitekturer och verkliga delar och komponenter av celler till utformningen av giftfria molekylär nivå enheter 12,15. Detta synsätt löser två frågo...

<ol><li> Xylen </li><li> 80 och 96% etanol. </li><li> 2% lösning av bovint serumalbumin (BSA) i destillerat vatten. </li><li> Oligonukleotid 1: en dubbel-hårnål, dubbla märkt med fluorescein och tetramethylrhodamine: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R på GCG TT-3 &quot;, F - FITC-dt, R - Tetramethylrhodamine-DT. Andra röda skiftat fluoroforer som BODIPY TR, Rhodamine eller Tamra kan användas i stället för tetramethylrhodamine som R. Alternativt kan du använda Oligonucleotide 2 -. Dubbel-hårnål enda märkta med fluorescein (för detektion av en enda typ av DNA-brott (DNas II-typ bara) Den enda fluoroforen bärande sond är betydligt billigare och är bekvämt när en enda typ av DNA-break är att vara märkta: 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &quot;, F - FITC-DT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonukleotid 3. Blunt-ended Rhodamine-märkta hårnål för förbättring av in situ ligation signal med T4 DNA-ligas: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 &quot;, R - Tetramethylrhodamine-DT </li><li> Vaccinia DNA topoisomeras l (VACC TOPO) - 3000 U / mikroliter (Vivid Technologies). I den inledande experimenten vi använde 215 pmoles (7,1 mikrogram) i VACC TOPO per varje 25 mikroliter av reaktionsblandningen. Däremot kan topoisomeras koncentrationen sänkas betydligt utan förlust av känslighet. Vi använde senare en fyra gånger mindre mängd VACC TOPO per sektion (1,76 mikrogram i 25 mikroliter av reaktionsblandningen per avsnitt) med liknande resultat. Att minska mängden av enzymet till 880 ng (i 25 mikroliter av reaktionsblandningen) resulterade i en svagare signal och 8,8 ng VACC TOPO gav inte några detekterbara signal. </li><li> T4 DNA-ligas 5 U / mikroliter (Roche). Denna starkt koncentrerade ligas beredning ger den bästa signalen i våra experimentella förhållanden. </li&gt; <li> 10 x reaktion buffert för T4 DNA-ligas: 660 mM Tris-HCl, 50 mm 2 MgCl, 10 mm dithioerythritol, 10 mm ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP i reaktion buffert är lätt förstörs i återkommande cykler av tining-frysning. Alikvotera bufferten i små 15-20 mikroliter portioner och förvara vid - 20 ° C. Använd en gång. </li><li> 30% (w / v) lösning av PEG-8000 (Sigma) i bidistilled vatten. 15% PEG-8000 i reaktionsblandningen stimulerar starkt att upptäcka, vilket ökar den effektiva koncentrationen av dess beståndsdelar i volym utslagning. </li><li> Proteinas K (Roche) 20 mg / ml stamlösning i destillerat vatten. Lagra vid - 20 ° C. Vid denna reaktion används 50mg/mL lösning i PBS, som framställs av beståndet. Återanvänd inte. </li><li> Vectashield med DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Natriumbikarbonat buffert: 50 M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8,2. </li><li> 22x22mm eller 22x40mm glas eller plast täckglas. Plast täckglas är att föredra under reaktionen, eftersom de enre lättare att ta bort från avsnittet. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Naturligt förekommande bio-molekylära maskiner fungerar i varje levande cell och visa en mängd olika utföranden 1-6. Men utvecklingen av konstgjorda molekylära maskiner fokuserar på anordningar som kan riktad rörelse, dvs molekylära motorer, och på deras förminskad mekaniska delar (hjul, axlar, hängen etc) 7-9. Detta imiterar makro-maskiner, även om de fysiska egenskaperna avgörande för dessa enheter, såsom tröghet och fart bevarande, inte kan användas i nanoworld miljöer 10. Alternativa utformningar, som inte följer den mekaniska macromachines system och använda mekanismer som utvecklats i utvecklingen av biologiska molekyler, kan dra nytta av de särskilda villkoren i nanoworld. Dessutom anpassar faktiska biologiska molekyler för tillämpningen av nano-design minskar potentiella faror nanoteknik produkterna kan medföra. Här kan vi visa på montering och tillämpning av en sådan bio-aktiverade konstruera, somEMI-konstgjorda molekylära enhet som kombinerar en naturligt förekommande molekylär maskin med konstgjorda delar. Från enzymologi synpunkt är vår konstruera en designer fluorescerande enzym-substrat komplex sätta ihop för att utföra en viss användbar funktion. Denna församling är per definition en molekylär maskin, eftersom det innehåller ett 12. Men dess integration med de tekniska delen - leder åter till en ny uppgift för märkning DNA-skador 12 - fluorescerande dubbla hårnål. Vår konstruera monterar ur en 32-Mer DNA och ett enzym vaccinia topoisomeras I (VACC Friluftskartan). Maskinen använder sedan sitt eget material för att tillverka två fluorescerande detektor enheter (Figur 1). En av de enheter (grön fluorescens) bär VACC TOPO kovalent knutna till sina 3&#39;end och en annan enhet (röd fluorescens) är ett fritt hårnål med en terminal 3&#39;OH. Enheterna är kortlivade och snabbt montera tillbaka till den ursprungliga konstruktionen, som därefter recleaves.I avsaknad av DNA-brott dessa två enheter kontinuerligt separata och religate i en cyklisk sätt. I vävnadssnitt med DNA-skador, de topoisomeras-bär detektorenhet selektivt fäster trubbig slutade DNA bryter 5&#39;OH (DNas II-typ raster) 11,12, fluorescerande märkning dem. Den andra enzym-fri hårnål bildas efter oligonukleotid klyvning kommer ligate en 5&#39;PO 4 trubbig slutade paus (DNase I-typ raster) 11,12, om T4 DNA-ligas är närvarande i lösningen 13,14. När T4 DNA-ligas läggs till i en vävnad avsnitt eller en lösning innehållande DNA med 5&#39;PO 4 trubbig slutade bryter reagerar ligas med 5&#39;PO 4 DNA ändar, som bildar semi-stabilt enzym-DNA-komplex. Den trubbiga slutade hårnålar kommer att interagera med dessa komplex släppa ligas och kovalent länka hårnålar till DNA, vilket märkning 5&#39;PO 4 trubbig slutade DNA raster. Denna utveckling är ett exempel på en ny praktisk inställning till the design av molekylära maskiner och ger en användbar för detektering av apoptos och DNA-skada i fasta celler och vävnader.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Vi visar montering och tillämpning av en molekylär skala enhet som drivs av en topoisomeras protein. Den konstruera är ett biomolekylära sensor som etiketter två huvudtyper av DNA-brott i vävnadssnitt genom att ansluta två olika fluoroforer till respektive sida.

In vitro-Montering av Semi-konstgjorda molekylär maskin och dess användning för detektion av DNA-skador

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Tillverkning av elektrokemiska-DNA biosensorer för att Reagentless Upptäckt av nukleinsyror, proteiner och små molekyler

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Syntes, församling, och karakterisering av monolager skyddade guld nanopartiklar Films för protein monolager Elektrokemi

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

CometChip: En hög kapacitet 96-Well-plattformen för att mäta DNA-skador i Microarrayed humana celler

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Användning av en hög kapacitet<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrofluidumanordning System för att utveckla muntliga Biofilmer Multi-arter

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning och montering av 3D mikrokärl

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatiserad robot vätskehantering montering av modulära DNA enheter

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Syntes av katjoniserad Magnetoferritin för ultrasnabb magnetiseringen av celler

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Konstruktion och användning av en elektrisk stimulering kammare för att förbättra osteogent differentiering i mesenkymala stamceller/stromaceller In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikel Mikroarrayer för chemotaktisk och molekylär analys av human neutrophil svärma in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...