Name: in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

Bu araştırma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme, Ulusal Sağlık Enstitüleri (VVD) ve National Institute of Nörolojik Bozukluklar ve İnme, Ulusal arra yoluyla Institutes of Health (VVD) ve R21 R21 NS064403 hibe hibe R01NS062842 tarafından desteklenen Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik EB006301 National Institute, National Institutes of Health (VVD).

Hazırlanması moleküler cihaz montajı daha fazla zaman alır, çünkü moleküler makine tabanlı tespiti için bölümler hazırlanmalıdır. Inşa paraformaldehid sabit, parafine gömülü doku blokları kesilmiş 5-6μm kalınlığında bölümleri ile iyi çalışır. ProbeOn Plus ücret ve precleaned slaytlar (Fisher Scientific) veya benzeri gibi iyi bölümlerde muhafaza slayt markalar kullanın. Biz deksametazon ile tedavi edilen apoptotik sıçan timus 13,14 DNaz I-ve DNaz II tipi molaları içeren...

<ol>
	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines.">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li><li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+machines,+Maxwell's+demon+and+living+organisms.">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li><li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+as+a+molecular+machine.">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li><li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

Bu videoda, bir çift etiketleme DNA hasarı sensörü montajı ve nasıl kullanılacağını göstermektedir. Sensörü, biyo-moleküler motor, yapay bileşenleri ile bağlantılı bir virüs kodlanan protein VACC TOPO tarafından yönlendirilen bir moleküler makine. Sunulan geliştirme, toksik olmayan moleküler ölçekli cihazların 12,15 tasarımı, biyolojik yapıları, mimarileri ve hücre gerçek parçaları ve bileşenleri adapte savunucuları bir biyo-etkin bir yaklaşım örneğidir. 1: Bu yaklaş?...

<ol><li> Ksilen </li><li> 80 ve% 96 Etanol. </li><li> Distile su (BSA), sığır serum albümin% 2&#39;lik solüsyon. </li><li> Oligonükleotid 1: bir çift-saç tokası, çift floresein ve tetramethylrhodamine ile etiketlenir: </li></ol> GCG AT 5&#39;-AAG GGA SKK GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R TT-3 &#39;F - FITC-dT; R - Tetramethylrhodamine-dT. BODIPY TR rodamin veya TAMRA gibi diğer kırmızı-kaymıştır fluorophores R olarak yerine tetramethylrhodamine kullanılabilir. Alternatif Oligonükleotid 2 kullanabilirsiniz. Floresein ile etiketlenmiş bir çift saç tokası single (tek bir DNA kırıkları tipi (DNaz II-tipi) tespiti için tek fluorofor taşıyan prob önemli ölçüde daha az pahalı ve rahat bir zaman tek bir DNA break tipi etiketli: 5&#39;-AAG GGA, SKK GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC- dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonükleotid 3. Tetramethylrhodamine-dT - R; 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3: T4 DNA ligaz ile yerinde ligasyon sinyal artırılması için künt uçlu rodamin etiketli saç tokası </li><li> Vaccinia DNA topoizomeraz l (VACC TOPO) - 3000 U / ml (Canlı Teknolojileri). İlk deneylerde reaksiyon karışımı her 25 mcL başına VACC TOPO 215 pmoles (7.1 mg) kullanılır. Ancak, hassasiyet kaybı olmadan topoizomeraz konsantrasyonunu önemli ölçüde azaltılabilir. Daha sonra benzer sonuçlar VACC TOPO (bölüm başına reaksiyon karışımı 25 mcL 1.76 mcg) Bölüm başına dört kat daha az miktarda kullanılır. 880 ng (25 mcL reaksiyon karışımı) enzimin miktarını azaltarak, daha zayıf bir sinyal ve 8.8 ng VACC TOPO saptanabilir sinyal üretti. </li><li> T4 DNA ligaz 5 U / ml (Roche). Bu son derece konsantre ligaz hazırlık deneysel koşullarda en iyi sinyal verir. </li&gt; <li> T4 DNA ligaz için 10 x reaksiyon tamponu: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7.5 (20 ° C) (Roche). ATP reaksiyon tamponu içinde çözülme-donma tekrarlayan döngüler halinde kolayca yok edilir. Kısım küçük 15-20 mcL bölümlerini ve mağaza tampon - 20 ° C bir kez kullanın. </li><li> Bidistile su PEG-8000 (Sigma)% 30 (w / v) solüsyonu. % 15 PEG-8000 reaksiyon karışımı hacmi dışlama bileşenlerinin etkili konsantrasyonları artan algılama uyarır. </li><li> Distile su proteinaz K (Roche) 20 mg / ml stok solüsyonu. Mağaza - 20 ° C PBS stok hazırlanan reaksiyon kullanımı 50mg/mL çözüm. Kullanmayın. </li><li> DAPI (vektör Laboratuvarlar) ile Vectashield. </li><li> Sodyum bikarbonat tampon: 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8.2. </li><li> 22x22mm veya 22x40mm cam ya da plastik lamelleri. Plastik lamelleri bir reaksiyon sırasında tercih edilirbölümünden kaldırmak için daha kolay yeniden. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Doğal olarak ortaya çıkan bio-moleküler makineler her canlı hücrenin çalışması ve çeşitli tasarımlar 1-6 gösterilecek. Ancak yönlü hareket, yani moleküler motorlar uyumlu cihazlar ve ölçekli aşağı mekanik parçalar (jantlar, aks, kolye vb) 7-9 yapay moleküler makineler merkezlerinin geliştirilmesi. Bu nanoworld ortamlarda 10, atalet ve momentum korunumu gibi, bu cihazlar için gerekli olan fiziksel özellikleri, kullanışlı olmasa bile, makro makineleri taklit eder . Nanoworld belirli koşulları, mekanik macromachines şemaları izleyin ve biyolojik moleküllerin evrimi geliştirilen mekanizmalar kullanmayın alternatif tasarımlar, yararlanabilirsiniz. Bunun yanı sıra, nano-tasarım amaçları için gerçek biyolojik moleküllerin adapte nanoteknoloji ürünleri oluşturabilecek potansiyel tehlikeleri azaltır. Burada, böyle bir biyo-uyumlu inşa montaj ve uygulamasını göstermekyapay bileşenleri ile doğal olarak ortaya çıkan moleküler makine birleştirir emi-yapay moleküler cihaz. Enzimoloji noktadan itibaren, bir yapı, bir tasarımcı floresan enzim-substrat kompleksi yararlı belirli bir işlevi gerçekleştirmek için bir araya koymak. Bu meclis, bir 12 içerdiğinden, tanımı gereği bir moleküler makine . Ancak, mühendislik bölümü ile entegrasyon - floresan çift saç tokası - DNA hasarını 12 etiketleme yeni bir görev için yeniden yönlendirir. Bizim yapı 32-mer DNA ve enzim vaccinia topoizomeraz I (VACC TOPO) toplanır. Makine daha sonra iki floresan etiketli detektör birimleri (Şekil 1) imal kendi malzeme kullanır. Birimlerden biri (yeşil floresan) VACC TOPO kovalent 3&#39;end ve başka bir birim (kırmızı floresan) bağlı bir terminal 3&#39;OH ile ücretsiz saç tokası taşır. Birimleri, kısa ömürlü ve hızlı bir şekilde, orijinal bir yapı, sonradan recleaves içine geri yenilemek.DNA yokluğunda bu iki ünite sürekli döngüsel bir şekilde ayrı ve religate kırar. DNA hasarı, topoizomeraz taşıyan dedektör ünitesi seçici floresan etiketleme 5&#39;OH (DNaz II tipi sonları): 11,12 künt uçlu DNA kırıkları verdiği doku kesitlerinde . T4 DNA ligaz 13,14 çözüm varsa oligonükleotid bölünme sonra oluşan ikinci, enzim ücretsiz saç tokası, 5&#39;PO 4 künt uçlu sonu (DNaz I-tipi sonları) 11,12 Arter olacak. T4 DNA ligaz bir doku bölüm veya 5&#39;PO 4 künt uçlu sonları ile DNA içeren bir çözüm için eklendiğinde, ligaz, yarı kararlı bir enzim-DNA kompleksleri oluşturarak, 5&#39;PO 4 DNA biter tepki verir . Künt sona erdi toka, böylece 5&#39;PO 4 künt uçlu DNA kırıkları etiketleme, DNA ligaz ve kovalent bağlantı toka serbest bu kompleksleri ile etkileşim olacaktır . Bu gelişme th için yeni bir pratik yaklaşım örneğidire moleküler makineler tasarım ve sabit hücre ve dokularında apoptozis ve DNA hasarı tespit için yararlı bir sensör sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Biz topoizomeraz bir protein tarafından desteklenmektedir moleküler ölçekli cihaz montaj ve uygulama göstermektedir. Inşa uçları iki farklı fluorophores ekleyerek doku kesitlerinde DNA kırıkları başlıca iki tipi etiketler moleküler biyo-sensör.

Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Monolayer sentezi, Montaj ve Karakterizasyonu Protein Monolayer Elektrokimya Korumalı Altın Nanopartikül Filmler

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Hücrelerin ultra hızlı Mıknatıslanma için katyonize Magnetoferritin sentezi

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

İnşaat ve in Vitro mezenkimal kök/Stromal hücrelerdeki Osteojenik farklılaşma güçlendirmeye yönelik bir elektriksel stimülasyon odası kullanımı

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

İnsan Nötrofil Swarming in vitro Kemotaktik ve Moleküler Analizi için Biyopartikül Mikrodizileri

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...