Name: isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Florida Center for Brain Tumor Forskning; Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapy.

1. Indsamling af primær GBM Tissue <ol><li> En glioblastom mutliforme (GBM) tumor er opnået fra en patient diagnosticeret med kræft og skal opereres. </li><li> Der skal træffes med neurokirurgi team. Den neurokirurg vil placere resekterede GBM tumor i en passende størrelse rør, der indeholder neurale stamceller (NSC) basal medium suppleret med 10-15% antibiotika (Peniciline / streptomycin). Kolde medium skal leveres til operationsstuen ved lab. Alternativt kold HEPES-buffer Minimum Essential Medium (HEM) eller fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med høj koncentration af antibiotika kan også bruges til dette formål. </li><li> Den resektion tumorvæv leveres til laboratoriet på is og placeres under kølerhjelmen. </li></ol> 2. Dissociation af primær tumor i encellede Suspension <ol><li> Overskud af det originale medie / PBS fjernes fra falk røret, og prøven er vasket 2-3 gange med 5-10ml PBS / NSC basal medium til at fjerne blod og snavs. PBS / Medium er fjernet, og GBM tumor væv er placeret i en petriskål. </li><li> Vævet skæres i små stykker og hakket med en nr. 10 skalpelblad i bittesmå stykker til at øge overfladearealet for trypsinization proces. Hakning kan tage 1-3 minutter afhængigt af størrelsen af ​​tumor. </li><li> Det hakkede væv er trypsinized i 3-5 ml forvarmet% 0,05 trypsin-EDTA i 10-15 minutter ved et 37 ° C vandbad. En elektronisk pipette bruges til at overføre den lille tumor stykker og trypsin i et 15 ml Falcon rør. </li><li> En lige så stor mængde af sojabønner trypsin inhibitor er tilføjet for at stoppe den enzymatiske trypsin reaktion efter inkubationstiden. </li><li> Trypsin inaktivering er sikret ved pipettering suspensionen op og ned flere gange. Derefter suspensionen er pelleterede nede ved centrifugering ved 800rpm (110g) i 5min. </li><li> Supernatanten kasseres, og vævet stykker er resuspenderes i 1 ml sterilt NSC basal medium. De klumper der dissocieres ved forsigtigt at pipettere op og ned (3-7 gange), indtil en glat mælket enkelt celle suspension er opnået. Antallet af pipettere trin direkte afhænger af størrelsen af ​​partikler i hakket væv. Langvarig og kraftig mekanisk dissociation bør undgås, da det kan medføre celledød og en reduktion i sfære formation. </li><li> For at fjerne un-opdelte stykker og snavs, er 10-15 ml af basal medium føjet til rør og cellesuspensionen er filtreret gennem et 40 mikron celle si i en 50ml tube. </li><li> Den filtrerede Suspensionen centrifugeres ved 800rpm (110g) i 5min. Supernatanten kasseres bagefter. </li><li> Pelletted celler bliver derefter resuspenderet i 1-2 ml af komplette NSC medium for celletælling. </li></ol> 3. Celletal og Belægning <ol><li> 10 μL af cellesuspensionen føjes til 90 μL af 0,04% Trypan blå i en 1 ml eppendorfrør. Bemærk: andre relevante celle fortyndingtioner kan også anvendes. </li><li> Pipette op og ned for at blande suspensionen. 10 μL af cellerne / trypan blå blanding overføres til hemocytometer med henblik på at tælle celle tæthed. </li><li> Celler er belagt i fuldstændig NSC medium (en blanding af NSC basal mellemstore og NSC spredning supplere med en 09:01-forholdet), suppleret med 20ng/ml Globaliseringsfonden, 10ng/ml bFGF og 1μl/ml på 0,2% heparin (2μg/ml) i passende vævskultur fartøjer. 5, 20 og 40 ml medium bruges til T25, T80 og T175 kolber, hhv. Antibiotika kan tilsættes til det medium i en koncentration på 1:100 for at mindske risikoen for forurening. </li><li> Kolben placeres i en inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO 2. </li></ol> 4. Passaging og udvidelse af GBM afledt områder: <ol><li> Når neurospheres nået en gennemsnitlig størrelse på 150-200 ìm i diameter, kulturen er klar til subkultur. Indholdet af hver kolbe fjernes og anbringes i en passende størrelse steril Tissue kultur rør og centrifugeres ved 800 rpm (110 g) i 5 min ved stuetemperatur. </li><li> Supernatanten fjernes, og pellet er resuspenderet i 1 ml% 0,05 trypsin-EDTA. </li><li> For at opnå en optimal trypsinization, er cellesuspensionen inkuberes ved 37 ° C i et vandbad i 2-3 min. For at stoppe trypsin aktivitet en tilsvarende mængde af sojabønner trypsin inhibitor føjes til cellesuspensionen og cellesuspensionen er forsigtigt pipetterede op og ned. </li><li> Cellesuspensionen centrifugeres ved 800 rpm (110g) i 5 min. Derefter er supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 ml NSC medium. </li><li> En celletal udføres som beskrevet tidligere. </li><li> Cellerne er belagt med en koncentration på 5x10 4 celler / ml i fuldstændig NSC medium suppleret med vækstfaktorer og forgyldt i passende størrelse vævskultur fartøjer som beskrevet i foregående del. </li><li> Sekundære neurospheres dannes i 7-10 dage, når de inkuberes ved 37 ° C i et fugtigtficeret inkubator med 5% CO 2. </li></ol> 5. Repræsentative resultater: Efter plating de enkelte celler høstet fra GBM tumor væv, formere tumor stamceller-lignende celler og generere små klynger af celler består af få celler i 3-4 dage (se video og figur 1). Efterhånden som disse klynger vokser, de får en mere sfærisk form, så med 7-8 dage, korrekt fase lyse kugler med en gennemsnitlig diameter på 150-200 mikrometer form (Se videoen og figur 2). Ved højere forstørrelse, som normalt sunde kugler demonstrere microspikes på deres periferi. At have store kugle lignende klynger i 1-2 dage efter kultur indledning skyldes eksistensen af ​​en ikke-opdelte klumper på binging af den kultur og bør ikke forveksles som sande sfærer. Mængden af ​​affald i primær tumor sfære kultur varierer afhængigt af den oprindelige kilde til væv og hvorvidt det inkluderer alle omkringliggende hjernevæv. Korrekt væv forberedelse teknikkerherunder enzymatiske og mekaniske dissociation, og efterfølgende filtrering af prøven med tilstrækkelig mængde medie kan resultere i mindre affald i kultur. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Primær GBM sfære kultur 4 dage efter plating. Tumor stamceller-lignende celler deler sig og skaber små klynger af celler i 3-4 dage. Original Forstørrelse; 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Passage en GBM sfære kultur 8 dage efter plating. Original Forstørrelse; 20x.

<ol>
	<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells.">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li><li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li><li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+purified+CD44++prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells.">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy.">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li><li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li><li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

At isolere neurale stamceller og stamceller fra normale voksne og føtale hjerner 1, 2, 3, 4 og også tumor stamceller-lignende celler fra kræft væv såsom lunger 5, prostata-6, bryst 7 og hjerne 8, 9, neurosphere analysen er blevet ofte bruges som den foretrukne metode. Ved hjælp af denne enkle og reproducerbare analyse, kan man generere et ubegrænset antal af celler fra resektion af tumorvæv, der viser samme karakteristika som somatiske stamceller; ex vivo multipotency, evnen til at skabe nye svulster på implantation, og selv-fornyelse. Disse celler kan bruges til at studere de grundlæggende kræft cellebiologi herunder celle-til-celle-interaktioner og differentiering, migration, invasion og celledød. Derudover giver isoleret tumor stamceller-lignende celler et uvurderligt værktøj til at studere, hvordan tumorer form, fremskridt og tilbagefald og også for at optrævle de underliggende følger cellulære mekanismer, der i sidste ende kan give indsigt til terapeutiskvalgmuligheder.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Type </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium (Human) </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC spredning Kosttilskud (Human) </td><td> Medium supplement </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> % 0,05 trypsin-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM komponent </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM komponent </td></tr><tr><td> * Destilleret vand </td><td> Reagens </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNase Jeg </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> ** Soybean trypsin inhibitor </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nr. 10 skalpelblad </td><td> Kirurgisk værktøj </td><td> BD </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td> Petriskål </td><td> Kultur-ware </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> En lille tang </td><td> Kirurgisk værktøjer </td><td> Fin Science Tools </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Cell si </td><td> Sieve </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 kolbe </td><td> Kultur-ware </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 kolbe </td><td> Kultur-ware </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml rør </td><td> Kultur-ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml rør </td><td> Kultur-ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Globaliseringsfonden </td><td> Vækstfaktor </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Vækstfaktor </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Vækstfaktor </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Rekonstitueret i PBS </td></tr></tbody></table> * For at gøre HEM, mix 1x10L pakke MEM and160ml af 1M HEPES og bringe mængden til 8,75 L med destilleret vand. Indstil den endelige PH til 7,4 end opbevare den ved 4 ° C. ** For at forberede trypsin inhibitor løsning, først lave 10 ml af DNase I-løsning (100 mg DNase opløst i 100 ml HEM) og derefter tilsættes 0,14 g trypsin inhibitor til DNase løsning og endelig gøre volumen op til 1 liter med HEM. Hold alikvoter af de endelige produkter i -20 ° C fryser.

isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay

Stem-lignende celler har været isoleret i tumorer såsom bryst-, lunge-, tyktarms-, prostata og hjerne. Et kritisk punkt i alle disse tumorer, især i glioblastom mutliforme (GBM), er at identificere og isolere tumorfremkaldende cellepopulation (r) til at undersøge deres rolle i tumordannelse, progression, og gentagelse. Forståelse tumorfremkaldende cellepopulationer vil give et fingerpeg om at finde effektive behandlingsmetoder for disse tumorer. Den neurosphere assay (NSA) på grund af sin enkelhed og reproducerbarhed er blevet brugt som den foretrukne metode til isolering og opformering af mange af denne tumorceller. Denne protokol viser neurosphere kultur metode til at isolere og udvide stamceller-lignende celler i kirurgisk resektion menneskelige GBM tumor væv. Procedurerne omfatter en indledende kemisk fordøjelse og mekanisk dissociation af tumorvæv, og efterfølgende plettering den resulterende enkelt celle suspension i NSA kultur. Efter 7-10 dage, neurospheres primære af 150-200 ìm i diameter kan observeres og er klar til yderligere passaging og ekspansion.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay at JoVE.com

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Denne video protokol viser isolation og udvidelse af stamceller lignende celler fra kirurgisk resektion menneskelige glioblastom mutliforme (GBM) tumor væv ved hjælp af neurosphere assay kultur metode.

Isolering og Udvidelse af menneskelige glioblastom multiforme tumorceller Brug af Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Isolering og dyrkning af humane Fungiform Taste papiller Celler

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering af pericyt-afledte Celler af Voksen Menneskelige hjerne til Inducerede Neuroner

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Kvantitativ måling af relative retinsyre Niveauer i E8.5 embryoner og neurosfære Cultures Brug af F9 RARE-LacZ Cell-baserede Reporter Assay

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Analyse af Spliceosomale snRNA-lokalisering i humane Hela-celler ved hjælp af mikroinjektion

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

Isolation og udvidelse af neurosfærer fra postnatal (P1-3) Mus neurogene nicher

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Afledning, ekspansion, kryopræservering og karakterisering af hjernemikrobielle endotelceller fra menneskeskabte pluripotente stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som et associativt læringsværktøj til kognitiv vurdering i lærings- og hukommelsesstudier ved hjælp af voksne zebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

Isolering, kultur og karakterisering af primære Schwann-celler, keratinocytter og fibroblaster fra human forhud

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...