Name: isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Florida Centre for hjernesvulst forskning; Preston A. Wells Jr Center for Brain Tumor Therapy.

1. Innsamling av Primary GBM Tissue <ol><li> En glioblastoma mutliforme (GBM) svulst er hentet fra en pasient diagnostisert med kreft og gjennomgår kirurgi. </li><li> Ordninger må gjøres med nevrokirurgi team. Nevrokirurgen vil plassere resected GBM svulst i en passende størrelse tube inneholder nevrale stamceller (NSC) basal medium supplert med 10-15% antibiotika (Peniciline / Streptomycine). Cold medium må gis til operasjonssalen av lab. Alternativt kald HEPES-bufret minimum viktig medium (HEM) eller fosfatbufret saltløsning (PBS) med høy konsentrasjon av antibiotika kan også brukes til dette formålet. </li><li> Den resected svulstvev leveres til laboratoriet på is og plassert under panseret. </li></ol> 2. Dissosiasjon av primærtumor i Single-Cell Suspension <ol><li> Overskudd av den opprinnelige medium / PBS er fjernet fra falk tube og prøven er vasket 2-3 ganger med 5-10ml av PBS / NSC basal medium for å fjerne blod og rusk. Den PBS / Medium er fjernet og GBM svulstvev er plassert i en petriskål. </li><li> Vevet er skåret i små biter og hakket med en nr. 10 skalpell blad i små biter for å øke arealet for trypsinization prosess. Hakking kan ta 1-3 minutter avhengig av størrelsen på svulsten. </li><li> Den hakket vevet er trypsinized i 3-5ml av forvarmet% 0,05 trypsin-EDTA i 10-15 minutter på et 37 ° C vannbad. En elektronisk pipette brukes til å overføre den lille svulst stykker og trypsin i en 15ml Falcon tube. </li><li> En tilsvarende volum av soyabønner trypsin inhibitor er lagt for å stoppe den enzymatiske trypsin reaksjon etter inkubasjonstiden. </li><li> Trypsin inaktivering sikres ved pipettering suspensjonen opp og ned flere ganger. Deretter er det fjæringen pelleterte nede ved sentrifugering på 800 omdr. (110g) for 5min. </li><li> Supernatanten er forkastet og vevet bitene er resuspendert i 1 ml sterile NSC basal medium. Den klumper er dissosiert ved forsiktig pipettering opp og ned (3-7 ganger) til en glatt melkeaktig enkelt celle suspensjon er oppnådd. Antallet pipettering steg avhenger direkte av størrelsen på partiklene i finhakket vev. Langvarig og kraftig mekanisk dissosiasjon bør unngås da det kan resultere i celledød og en reduksjon i sfære formasjon. </li><li> Slik fjerner un-dissosiert biter og rusk, er 10-15 ml basal medium lagt til røret og cellesuspensjonen er filtrert gjennom en 40 micron celle sil i en 50ml tube. </li><li> Den filtrerte Fjæringen er sentrifugeres ved 800 omdr. (110g) for 5min. Supernatanten forkastes etterpå. </li><li> Pelletted cellene blir deretter resuspendert i 1-2 ml av komplette NSC medium for celle teller. </li></ol> 3. Celletall og Plettering <ol><li> 10 mL av cellen suspensjon er lagt til 90 mL av 0,04% Trypan blå i en 1 ml Eppendorf rør. Merknad: annet passende celle dilusjoner kan også brukes. </li><li> Pipetter opp og ned for å blande suspensjonen. 10 mL av celler / trypan blå blandingen er overført til hemocytometer for å telle celle tetthet. </li><li> Cellene er belagt i fullstendig NSC medium (en blanding av NSC basal medium og NSC spredning supplement til en 9:01 ratio) supplert med 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF og 1μl/ml på 0,2% heparin (2μg/ml) i passende vev kultur fartøy. 5, 20 og 40 ml medium brukes for T25, T80 og T175 kolber, henholdsvis. Antibiotika kan legges til mediet på en konsentrasjon av 1:100 for å redusere sjansen for forurensning. </li><li> Flasken er plassert i en inkubator innstilt på 37 ° C og 5% CO 2. </li></ol> Fire. Passaging og utvidelse av GBM avledet sfærer: <ol><li> Når neurospheres nådd en gjennomsnittlig størrelse på 150-200 mikrometer i diameter, er kulturen klar for subkultur. Innholdet i hver kolbe er fjernet og plassert i en passende størrelse steril Tissue kultur tube, og sentrifugeres på 800 rpm (110 g) i 5 min ved romtemperatur. </li><li> Supernatanten fjernes og pelleten er resuspendert i 1 ml av% 0,05 trypsin-EDTA. </li><li> For å oppnå en optimal trypsinization er cellesuspensjonen inkubert ved 37 ° C i vannbad i 2-3 min. For å stoppe trypsin aktiviteten et likt volum av soyabønner trypsin inhibitor er lagt til cellesuspensjonen og cellesuspensjonen er forsiktig pipetteres opp og ned. </li><li> Cellen Fjæringen er sentrifugeres ved 800 rpm (110g) i 5 min. Deretter er supernatanten fjernes og cellene er resuspendert i 1 ml av NSC medium. </li><li> En celle teller er utført som beskrevet tidligere. </li><li> Cellene er belagt i en konsentrasjon på 5x10 4 celler / ml i fullstendig NSC medium supplert med vekstfaktorer og belagt i passende størrelse vevskultur fartøy som beskrevet i forrige del. </li><li> Sekundære neurospheres dannes i 7-10 dager da inkubert ved 37 ° C i en fuktigifisert kuvøse med 5% CO 2. </li></ol> 5. Representant Resultater: Etter plating av enkeltceller høstet fra GBM svulstvev, tumor stilk-lignende celler spre seg og generere små klynger av celler består av få celler i 3-4 dager (se video og Figur 1). Som disse klyngene vokse, få de en mer sfærisk form, slik at ved 7-8 dager, riktig fase lyse kuler med en gjennomsnittlig diameter på 150-200 mikrometer form (Se video og Figur 2). Ved høyere forstørrelse, sunn sfærer vanligvis demonstrere microspikes i periferien deres. Å ha store området som klynger på 1-2 dager etter kultur innvielsen skyldes eksistensen av ikke-dissosiert klumper på binging av kultur og bør ikke forveksles som sant sfærer. Mengden av vrakgods i primærtumor sfære kultur varierer avhengig av den opprinnelige kilden til vev og hvorvidt den inkluderer noen omkringliggende hjernevev. Riktig vev forberedelse teknikkerinkludert enzymatiske og mekanisk dissosiasjon, og etterfølgende filtrering av prøven med tilstrekkelig mengde medium kan resultere i mindre rusk i kultur. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Primær GBM sfære kultur 4 dager etter plating. Tumor stilk-lignende celler spre seg og generere små klynger av celler i 3-4 dager. Original Forstørrelse: 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Passage en GBM sfære kultur 8 dager etter plating. Original Forstørrelse: 20x.

<ol>
	<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells.">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li><li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li><li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+purified+CD44++prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells.">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy.">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li><li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li><li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Å isolere nevrale stamceller og stamceller fra normal voksen og fosterets hjerne 1, 2, 3, 4 og også tumor stilk-lignende celler fra cancer vev som fem lunge-, prostata-6, bryst 7 og 8 hjerne, 9 den neurosphere analysen har vært hyppig brukt som metode for valg. Ved hjelp av denne enkle og reproduserbare analysen, kan man generere et ubestemt antall celler fra resected svulstvev som viser lignende egenskaper som somatiske stamceller; ex vivo multipotency, evnen til å skape nye svulster etter implantasjon, og selvfornyelse. Disse cellene kan brukes til å studere grunnleggende kreft cellebiologi inkludert celle-til-celle interaksjoner, og differensiering, migrasjon, invasjon og celledød. I tillegg isolerte tumor stilk-lignende celler gir et uvurderlig verktøy for å studere hvordan svulster form, fremdrift, og tilbakefall og også å avdekke de underliggende deriving cellulære mekanismene som til slutt kunne gi innsikt til terapeutiskalternativer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Type </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium (Human) </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC spredning Supplements (Human) </td><td> Medium supplement </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> % 0,05 trypsin-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM komponent </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM komponent </td></tr><tr><td> * Destillert vann </td><td> Reagens </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNase I </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> ** Soybean trypsin inhibitor </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nr. 10 skalpell blad </td><td> Kirurgisk verktøy </td><td> BD </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td> Petri Dish </td><td> Kultur-ware </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Liten tang </td><td> Kirurgisk verktøy </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Cell sil </td><td> Sil </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 kolbe </td><td> Kultur-ware </td><td> Nalge Nunc internasjonale </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 kolbe </td><td> Kultur-ware </td><td> Nalge Nunc internasjonale </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml rør </td><td> Kultur-ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml rør </td><td> Kultur-ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Vekstfaktor </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Vekstfaktor </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Vekstfaktor </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Rekonstituert i PBS </td></tr></tbody></table> * For å lage HEM, bland 1x10L pakke MEM and160ml av 1M HEPES og bringe volumet til 8,75 L med destillert vann. Sett den endelige PH til 7,4 end lagre den ved 4 ° C. ** For å forberede trypsin inhibitor løsningen, først gjøre 10 ml DNase I løsning (100 mg DNase oppløst i 100 ml HEM) og deretter legge til 0,14 g av trypsin inhibitor til DNase løsning og til slutt gjøre volumet opp til 1 Liter med HEM. Hold alikvoter av de endelige produktene i -20 ° C fryseboks.

isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay

Stem-lignende celler har vært isolert i svulster som bryst, lunge, tykktarm, prostata og hjerne. Et kritisk problem i alle disse svulstene, spesielt i glioblastom mutliforme (GBM), er å identifisere og isolere tumor initiere celle befolkning (r) for å undersøke deres rolle i tumordannelse, progresjon, og gjentakelse. Forstå tumor initiere celle populasjoner vil gi ledetråder for å finne effektive terapeutiske tilnærminger for disse svulstene. Den neurosphere analysen (NSA) på grunn av sin enkelhet og reproduserbarhet har vært brukt som metode for valg for isolasjon og spredning av mange av denne kreftceller. Denne protokollen demonstrerer neurosphere kultur metoden for å isolere og utvide stilk-lignende celler i kirurgisk resected human GBM svulstvev. Prosedyrene har en innledende kjemisk fordøyelsen og mekanisk dissosiasjon av svulstvev, og senere plating den resulterende eneste celle suspensjon i NSA kultur. Etter 7-10 dager, primære neurospheres av 150-200 mikrometer i diameter kan observeres og er klar for videre passaging og ekspansjon.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay at JoVE.com

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Denne videoen protokoll demonstrerer isolasjon og utvidelse av stamceller som celler fra kirurgisk resected human glioblastoma mutliforme (GBM) svulstvev bruker neurosphere analysen kulturen metoden.

Isolasjon og utvidelse av Human glioblastoma multiforme kreftceller Bruke Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Isolering og kultur for Human Fungiform Taste papillae Cells

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-deriverte celler av den voksne Human Brain inn Utførte Nerveceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Kvantitativ måling av relativ retinsyre Levels i E8.5 embryoer og neurosfære kulturer Bruke F9 RARE-lacZ Cell-baserte reporter analysen

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Analyse av Spliceosomal snRNA lokalisering i Human Hela Cells bruke Microinjection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

Isolasjon og utvidelse av nevrosfærer fra postnatal (P1-3) Mus Neurogenic nisjer

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Avledning, utvidelse, kryopreservasjon og karakterisering av mikrovaskulære endotelceller fra humane induserte pluripotente stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som et assosiativt læringsverktøy for kognitiv vurdering i lærings- og minnestudier ved hjelp av voksen sebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

Isolasjon, kultur og karakterisering av primære Schwann-celler, Keratinocytter og Fibroblaster fra Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...