Name: isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00
Duration: 9 min 24 s
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Este trabalho foi financiado por doações do Centro de Pesquisa Florida tumor cerebral; Preston A. Wells Jr. Centro de Terapia tumor cerebral.

1. Coleta de Tecido GBM primário <ol><li> A glioblastoma mutliforme tumor (GBM) é obtido a partir de um paciente diagnosticado com o câncer e submetidos a cirurgia. </li><li> Providências devem ser feitas com a equipe de neurocirurgia. O neurocirurgião vai colocar o tumor ressecado GBM em um tubo de tamanho apropriado que contém células-tronco neurais (NSC) meio basal suplementado com antibióticos 10-15% (Peniciline / estreptomicina). Meio frio deve ser fornecida à sala de cirurgia por laboratório. Alternativamente, frio HEPES-buffered meio mínimo essencial (HEM) ou tampão fosfato salino (PBS) com alta concentração de antibióticos também pode ser usado para esta finalidade. </li><li> O tecido do tumor ressecado é entregue ao laboratório em gelo e colocado sob o capô. </li></ol> 2. Dissociação do tumor primário em uma única célula Suspensão <ol><li> Excesso do meio original / PBS é removido do tubo falcon ea amostra é lavado 2-3 vezes com 5-10ml de PBS / NSC meio basal para remover o sangue e detritos. A PBS / Medium é removido eo tecido do tumor GBM é colocado em uma placa de Petri. </li><li> O tecido é cortado em pedaços pequenos e picada com uma lâmina de bisturi n º 10 em pedaços pequenos para aumentar a área de superfície para o processo de tripsinização. Picadura pode demorar alguns minutos 1-3, dependendo do tamanho do tumor. </li><li> O tecido é picada tripsinizados em 3-5ml de pré-aquecido 0,05% tripsina-EDTA por 10-15 minutos em banho-maria a 37 ° C. Uma pipeta eletrônico é usado para transferir as peças de tumor pequeno e tripsina em um tubo Falcon 15ml. </li><li> Um volume igual de inibidor de tripsina de soja é adicionada para parar a reacção enzimática de tripsina após o período de incubação. </li><li> Inativação da tripsina é assegurada por pipetagem de suspensão para cima e para baixo várias vezes. Então, a suspensão é peletizada para baixo por centrifugação a 800rpm (110g) para 5min. </li><li> O sobrenadante é descartado e os pedaços de tecido são suspensas em 1 ml de estéril NSC bamédio sal. Os aglomerados são dissociados por pipetagem suavemente para cima e para baixo (3-7 vezes) até que uma suspensão de células lisas única leitosa é obtida. O número de etapas de pipetagem depende diretamente do tamanho das partículas no tecido picada. Longa e vigorosa dissociação mecânica deve ser evitado, pois pode resultar em morte celular e uma redução na formação de esfera. </li><li> Para remover un-dissociada pedaços e fragmentos, 10-15 ml de meio basal é adicionado ao tubo e da suspensão de células é filtrada através de um filtro celular 40 mícrons em um tubo de 50ml. </li><li> A suspensão é filtrada centrifugado a 800rpm (110g) para 5min. O sobrenadante é descartado depois. </li><li> Pelletted células são então ressuspenso em 1-2ml de meio de NSC completa para contagem das células. </li></ol> 3. Contagem de Células e Galvanização <ol><li> 10 mL da suspensão de células é adicionado a 90 mL de 0,04% Trypan azul em um tubo eppendorf de 1ml. Nota: outras células diluição adequadações também podem ser usados. </li><li> Pipeta cima e para baixo para misturar a suspensão. 10 L das células / mistura de azul de tripano é transferido para hemocitômetro para contagem de densidade celular. </li><li> Células são banhados em meio NSC completa (uma mistura de NSC meio basal e complementar NSC proliferação em uma proporção de 9:1), suplementado com 20ng/mL EGF, bFGF e 10ng/ml 1μl/ml de heparina 0,2% (2μg/ml) em vasos de cultura apropriado tecido. 5, 20 e 40 ml de meio é usado para frascos T25, T80 e T175, respectivamente. Antibióticos podem ser adicionadas ao meio em uma concentração de 1:100 para diminuir chances de contaminação. </li><li> O balão é colocado em uma incubadora regulada a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> 4. Passaging e expansão do GBM esferas derivados: <ol><li> Quando o neurospheres chegou a um tamanho médio de 150-200 m de diâmetro, a cultura está pronta para subcultura. O conteúdo de cada balão é retirado e colocado em um tamanho adequado tiss estérilue tubo de cultura, e centrifugados a 800 rpm (110 g) por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> O sobrenadante é removido eo pellet é ressuspenso em 1 ml de 0,05% tripsina-EDTA. </li><li> Para conseguir um ótimo tripsinização, a suspensão celular é incubada a 37 ° C em banho-maria por 2-3 min. Para interromper a atividade de tripsina um volume igual de inibidor de tripsina de soja é adicionada à suspensão de células e suspensão de células é suavemente pipetado cima e para baixo. </li><li> A suspensão celular é centrifugado a 800 rpm (110g) por 5 min. Em seguida, o sobrenadante é removido e as células são ressuspendidas em 1 ml de meio de NSC. </li><li> A contagem de células é realizada conforme descrito anteriormente. </li><li> As células são banhados em uma concentração de 5x10 4 células / ml em meio NSC completo suplementado com fatores de crescimento e semeadas em vasos de tamanho apropriado de cultura de tecidos como descrito na parte anterior. </li><li> Neurospheres secundário são formados no dia 10/07 quando incubados a 37 ° C em um úmidoified incubadora com 5% de CO 2. </li></ol> 5. Resultados representativos: Após o plaqueamento das células individuais colhidos GBM tecido tumoral, tumor de células-tronco como proliferar e gerar pequenos aglomerados de células composto por poucas células em 3-4 dias (veja o vídeo e Figura 1). Como estes grupos crescem, eles adquirem uma forma mais esférica de modo que, 7-8 dias, esferas fase adequada brilhante com um diâmetro médio de 150-200 formulário microns (Veja o vídeo e Figura 2). Na maior ampliação, esferas saudável geralmente demonstram microspikes em sua periferia. Tendo como grande esfera clusters em 1-2 dias após o início da cultura é devido à existência de não-dissociada aglomerados na binging da cultura e não deve ser confundido como esferas de fato. A quantidade de detritos na cultura esfera tumor primário varia de acordo com a fonte inicial de tecido e se é ou não inclui qualquer tecido cerebral circundante. Técnicas de preparação adequada do tecidoincluindo dissociação enzimática e mecânica, e posterior filtração da amostra com uma quantidade suficiente de médio pode resultar em menos detritos na cultura. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esfera da cultura primária GBM quatro dias após o plaqueamento. Tumor-tronco como células proliferam e geram pequenos aglomerados de células em 3-4 dias. Ampliação original; 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Passage uma cultura esfera GBM 8 dias após o plaqueamento. Ampliação original; 20x.

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	<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells.">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li><li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li><li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+purified+CD44++prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells.">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy.">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li><li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li><li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para isolar-tronco neurais e células progenitoras de adultos normais e cérebros fetal 1, 2, 3, 4 e também tumor-tronco como células dos tecidos do câncer, como pulmão 5, 6 de próstata, mama e cérebro 7 8, 9, o ensaio foi neurosphere freqüentemente usado como o método de escolha. Com este ensaio simples e reprodutível, pode-se gerar um número indefinido de células do tecido do tumor ressecado que mostram características similares como células-tronco somáticas; multipotency ex vivo, a capacidade de criar novos tumores após o implante, e auto-renovação. Essas células poderiam ser usadas para estudar a biologia celular básica, incluindo câncer de célula a célula-interações, e, a diferenciação de migração, invasão e morte celular. Além disso, isolado tumor-tronco como células fornecem uma ferramenta valiosa para estudar como os tumores de forma, o progresso ea recaída e também para desvendar os mecanismos celulares subjacentes decorrentes que, eventualmente, poderiam fornecer insights para terapêuticaopções.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium (Humana) </td><td> Médio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Suplementos Proliferação (Humana) </td><td> Suplemento médio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> Componente HEM </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Componente HEM </td></tr><tr><td> * A água destilada </td><td> Reagente </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNase I </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> ** Inibidor de tripsina de soja </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> No. 10 lâmina de bisturi </td><td> Ferramenta cirúrgica </td><td> BD </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td> Petri Dish </td><td> Cultura software </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Pequeno fórceps </td><td> Instrumentos cirúrgicos </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Coador celular </td><td> Peneira </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 frasco </td><td> Cultura software </td><td> Nalge Nunc internacionais </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 frasco </td><td> Cultura software </td><td> Nalge Nunc internacionais </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de 15 ml </td><td> Cultura software </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de 50 ml </td><td> Cultura software </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Fator de crescimento </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Fator de crescimento </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Fator de crescimento </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Reconstituído em PBS </td></tr></tbody></table> * Para fazer HEM, mix de pacotes 1x10L de MEM and160ml de HEPES 1M e obter um volume de 8,75 L com água destilada. Definir o pH final para 7,4 umd armazenar a 4 ° C. ** Para preparar solução inibidora de tripsina, primeiro fazer 10 ml de solução de DNase I (100 mg DNase dissolvida em 100 ml de HEM) e em seguida, adicionar 0,14 g de inibidor de tripsina para a solução DNase e, finalmente, tornar o volume até 1 litro utilizando HEM. Manter as alíquotas dos produtos finais em -20 ° C freezer.

isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay

-Tronco como células foram isoladas em tumores como mama, pulmão, cólon, próstata e cérebro. Uma questão crítica em todos estes tumores, especialmente em mutliforme glioblastoma (GBM), é identificar e isolar a população de células tumorais iniciar (s) para investigar o seu papel na formação de tumores, progressão e recorrência. Tumor compreensão iniciar populações de células irá fornecer pistas para encontrar abordagens terapêuticas eficazes para estes tumores. O ensaio neurosphere (NSA), devido à sua simplicidade e reprodutibilidade tem sido utilizado como o método de escolha para isolamento e propagação de muitas das células tumorais isso. Este protocolo demonstra o método de cultura neurosphere para isolar e expandir-tronco como células no tecido humano ressecado cirurgicamente GBM tumor. Os procedimentos incluem uma digestão química inicial e dissociação mecânica do tecido tumoral e, posteriormente, chapeamento da suspensão de células resultantes único da cultura NSA. Após 70-10 dias, neurospheres primária de 150-200 m de diâmetro podem ser observadas e estão prontos para mais passaging e expansão.

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Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Este protocolo vídeo demonstra o isolamento e expansão de células-tronco como de mutliforme glioblastoma humano ressecado cirurgicamente (GBM) tecido tumoral utilizando o método de cultura neurosphere ensaio.

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