Name: isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från Florida Centrum för hjärntumör forskning, Preston A. Wells Jr Centrum för hjärntumör terapi.

1. Insamling av primär GBM Tissue <ol><li> En glioblastom mutliforme (GBM) tumör erhålls från en patient med diagnosen cancer och som genomgår kirurgi. </li><li> Arrangemang måste göras med neurokirurgi team. Den neurokirurg placerar opererande GBM tumör i en lämplig storlek röret med neurala stamceller (NSC) bassubstratets kompletteras med 10-15% antibiotika (Peniciline / streptomycin). Kalla medelstora måste ges till operationssalen med lab. Alternativt kall HEPES-buffrad minst viktigt medium (HEM) eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med hög koncentration av antibiotika kan också användas för detta ändamål. </li><li> Den opererande tumörvävnad levereras till labbet på is och placeras under huven. </li></ol> 2. Dissociation av primärtumör till encelliga Suspension <ol><li> Överstiger den ursprungliga medium / PBS tas bort från falken röret och provet tvättas 2-3 gånger med 5-10ml PBS / NSC bassubstratets att ta bort blod och smuts. PBS / Medium tas bort och GBM tumörvävnad placeras i en petriskål. </li><li> Vävnaden skärs i små bitar och malet med en nr 10 skalpell blad i små bitar för att öka ytan för trypsinization process. Finhacka kan ta 1-3 minuter beroende på storleken av tumören. </li><li> Den malda vävnad är trypsinized i 3-5 ml förvärmda% 0,05 trypsin-EDTA i 10-15 minuter vid 37 ° C vattenbad. En elektronisk pipett används för att överföra den lilla tumören bitar och trypsin i en 15 ml Falcon rör. </li><li> En lika stor volym av sojabönor trypsin inhibitor läggs för att stoppa den enzymatiska trypsin reaktion efter inkubationstiden. </li><li> Trypsin inaktivering säkerställs genom att pipettera suspensionen upp och ned flera gånger. Då är suspensionen pelleterat ner genom att centrifugera vid 800rpm (110g) för 5min. </li><li> Supernatanten tas bort och vävnaden bitarna är suspenderade i 1 ml steril NSC basal medium. De klumpar är dissocierade genom att försiktigt pipettera upp och ned (3-7 gånger) tills en slät mjölkig enda cell suspension erhålls. Antalet pipetteringssteg är direkt beroende av storleken på partiklar i malet vävnad. Långa och kraftig mekanisk dissociation bör undvikas eftersom det kan leda till celldöd och minskad sfär bildas. </li><li> Att ta bort onödiga dissocierade bitar och skräp, är 10-15 ml bassubstratets läggs till röret och cellsuspension filtreras genom ett 40 mikron cell sil i en 50 ml tub. </li><li> Den filtrerade suspension centrifugeras vid 800rpm (110g) för 5min. Supernatanten tas bort efteråt. </li><li> Pelletted cellerna då suspenderade i 1-2ml av kompletta NSC medium för cell räkna. </li></ol> 3. Celltal och plätering <ol><li> 10 mikroliter av cellsuspensionen läggs till 90 mikroliter av 0,04% Trypan blå i en 1 ml Eppendorf-rör. Obs: andra lämpliga celler utspädningtioner kan också användas. </li><li> Pipettera upp och ner för att blanda suspension. 10 mikroliter av cellerna / trypan blå blandning överförs till hemocytometer för att räkna celltätheten. </li><li> Celler är pläterade helt NSC medium (en blandning av NSC bassubstratets och NSC spridning tillägg på ett 9:1-förhållande) kompletteras med 20ng/ml fonden 10ng/ml bFGF och 1μl/ml på 0,2% heparin (2μg/ml) i lämpligt vävnadskultur fartyg. 5, 20 och 40 ml medium används för T25, T80 och T175 kolvar, respektive. Antibiotika kan läggas till mediet vid en koncentration av 1:100 för att minska risken för kontamination. </li><li> Kolven placeras i en inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO 2. </li></ol> 4. Passaging och utbyggnad av GBM härrör sfärer: <ol><li> När neurospheres nått en genomsnittlig storlek på 150-200 mikrometer i diameter, är kulturen redo för subkultur. Innehållet i vardera kolven tas bort och placeras i en lämplig storlek steril TissUE kultur rör och centrifugeras vid 800 rpm (110 g) i 5 minuter vid rumstemperatur. </li><li> Supernatanten bort och pellets är suspenderade i 1 ml% 0,05 trypsin-EDTA. </li><li> För att uppnå en optimal trypsinization är cellsuspension inkuberas vid 37 ° C i ett vattenbad i 2-3 min. För att stoppa trypsin verksamheten en lika stor volym soja trypsin inhibitor läggs till cellsuspension och cellsuspension är försiktigt pipetteras upp och ner. </li><li> Cellsuspensionen är centrifugeras vid 800 rpm (110g) i 5 minuter. Då är supernatanten bort och cellerna är suspenderade i 1 ml NSC medium. </li><li> En celler utförs enligt beskrivningen tidigare. </li><li> Cellerna är klädd i en koncentration av 5x10 4 celler / ml i hela NSC mediet kompletteras med tillväxtfaktorer och klädd i lämpliga kultur storlek vävnad fartyg som beskrivits i tidigare del. </li><li> Sekundära neurospheres bildas i 7-10 dagar när de inkuberas vid 37 ° C i en fuktigified inkubator med 5% CO 2. </li></ol> 5. Representativa resultat: Efter förkromning den enskilda celler skördas från GBM tumörvävnad, tumör stamceller-liknande celler föröka sig och skapa små kluster av celler som består av några få celler i 3-4 dagar (se videon och Figur 1). Eftersom dessa kluster växer, få de en mer sfärisk form så att vid 7-8 dagar, i rätt fas lysande klot med en genomsnittlig diameter av 150-200 mikron form (se videon och figur 2). Vid högre förstoring, friska kulor visar oftast microspikes på deras periferi. Med stor sfär som kluster inom 1-2 dagar efter kultur initiering beror på att förekomsten av icke-differentierade klumpar på binging av kulturen och bör inte förväxlas som sanna sfärer. Mängden skräp i primärtumör sfär kultur varierar beroende på den ursprungliga källan till vävnad och om det finns någon omgivande hjärnvävnad. Rätt vävnad förberedelse teknikerinklusive enzymatisk och mekanisk dissociation, och efterföljande filtrering av provet med en tillräcklig mängd medium kan resultera i mindre skräp i kulturen. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Primär GBM sfär kultur 4 dagar efter plätering. Tumör stam-liknande celler föröka sig och skapa små kluster av celler i 3-4 dagar. Original Förstoring, 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Passage en GBM sfär kultur 8 dagar efter plätering. Original Förstoring, 20x.

<ol>
	<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells.">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li><li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li><li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+purified+CD44++prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells.">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy.">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li><li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li><li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Att isolera neurala stamceller och progenitorceller från normala vuxna och foster hjärnor 1, 2, 3, 4 och också tumör stamceller-liknande celler från cancer vävnader såsom lungor 5, prostata-6, bröst 7 och hjärna 8, 9 av neurosphere analysen har ofta som den metod som föredras. Med denna enkla och reproducerbara analys, kan man skapa ett oändligt antal celler från opererande tumörvävnad som visar liknande egenskaper som somatiska stamceller, ex vivo multipotency, förmågan att skapa nya tumörer efter implantation, och självförnyelse. Dessa celler kan användas för att studera grundläggande biologi cancercellen inklusive cell till cell interaktioner, och differentiering, migration, invasion och celldöd. Dessutom isolerad tumör stamceller-liknande celler ger ett ovärderligt verktyg för att studera hur tumörer form, framsteg och återfall och även att riva upp de bakomliggande härrör cellulära mekanismer som så småningom skulle kunna ge insikter till terapeutiskalternativ.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Typ </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC bassubstratets (Human) </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05.750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC spridning Supplements (Human) </td><td> Medium komplettera </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05.753 </td><td></td></tr><tr><td> % 0,05 trypsin-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM komponent </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM komponent </td></tr><tr><td> * Destillerat vatten </td><td> Reagens </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNas jag </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 104.159 </td><td></td></tr><tr><td> ** Sojabönor trypsin inhibitor </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Penna / Strep </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nr 10 skalpell blad </td><td> Kirurgiska verktyg </td><td> BD </td><td> 371.610 </td><td></td></tr><tr><td> Petriskål </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 353.003 </td><td></td></tr><tr><td> Liten tång </td><td> Kirurgiska instrument </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Cell sil </td><td> Sieve </td><td> BD Falcon </td><td> 352.340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 kolv </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc internationella </td><td> 136.196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 kolv </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc internationella </td><td> 178.905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml rör </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352.096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml rör </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352.070 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Tillväxtfaktor </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Tillväxtfaktor </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Tillväxtfaktor </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Färdigberedd i PBS </td></tr></tbody></table> * För att göra HEM, blanda 1x10L paket MEM and160ml 1M HEPES och föra volymen till 8,75 L med destillerat vatten. Ställ den slutliga PH till 7,4 end förvaras vid 4 ° C. ** För att förbereda trypsininhibitorerna lösning, först göra 10 ml av DNas Jag lösning (100 mg DNas upplöst i 100 ml HEM) och sedan lägga till 0,14 g trypsin inhibitor till DNas lösning och slutligen att volymen till 1 liter med HEM. Håll alikvoter av slutprodukterna i -20 ° C frys.

isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay

Stem-liknande celler som har isolerats i tumörer, såsom bröst-, lung-, tjocktarms-, prostata och hjärna. En kritisk fråga i alla dessa tumörer, särskilt i glioblastom mutliforme (GBM) är att identifiera och isolera tumörer cellpopulation (s) för att undersöka deras roll i tumörbildning, progression och upprepning. Förstå tumörer cellpopulationer ger ledtrådar till att finna effektiva behandlingsmetoder för dessa tumörer. Den neurosphere analys (NSA) på grund av sin enkelhet och reproducerbarhet har använts som metod i valet för isolering och förökning av många av denna tumörceller. Detta protokoll visar neurosphere kultur metod för att isolera och expandera stamceller-liknande celler i kirurgiskt avlägsnade mänskliga GBM tumörvävnad. De förfaranden inkluderar en inledande kemisk nedbrytning och mekanisk dissociation av tumörvävnad, och därefter plätering den resulterande enskild cell suspension i NSA kultur. Efter 7-10 dagar, primär neurospheres på 150-200 mikrometer i diameter kan observeras och är redo för ytterligare passaging och expansion.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay at JoVE.com

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Denna video protokoll visar isolering och utbyggnad av stamceller som celler från kirurgiskt avlägsnade mänskliga glioblastom mutliforme (GBM) tumörvävnad med hjälp av neurosphere metoden analys kultur.

Isolering och utbyggnad av tumour glioblastoma multiforme celler med Neurosphere analys

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utvidgning av den vuxna Mouse neurala stamceller Använda Neurosphere analys

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Etablera Embryonala Mus Neurala Kultur Stem Cell Använda Neurosphere analys

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Isolering och kultur mänskliga papiller Fungiform smak celler

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-härledda celler i den vuxna mänskliga hjärnan i inducerade Nervceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Kvantitativ mätning av relativ retinsyra nivåer i E8.5 embryon och neurosfärkulturer med hjälp av F9 sällsynta LacZ Cell-baserad Reporter analys

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Analys av Spliceosomal snRNA lokalisering i mänskliga hela celler med mikroinjektion

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal P1ÃƒÂ¢Ã‹â€ '3 Mouse Neurogenic Niches

Isolering och expansion av neurosfärer från Postnatala (P1−3) Mus neurogena nischer

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Härledning, expansion, kryopreservation och karakterisering av hjärnans mikrovaskulära endotelceller från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som ett associativt inlärningsverktyg för kognitiv bedömning i inlärnings- och minnesstudier med vuxen zebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

Isolering, kultur och karakterisering av primära Schwann-celler, keratinocyter och fibroblaster från mänsklig förhud

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...